通過結構仿生與功能整合，不僅為腸道感染機制研究提供了動態平臺，還為抗菌藥物（尤其是噬菌體療法）的高通量篩選開辟了新路徑，其核心優勢在于三維結構誘導的組織功能化與快速生理響應能力，顯著提升了體外模型與體內環境的一致性。

一、腸道感染建模實驗步驟

1. 模型準備與細菌培養

- 組織模型構建：將Caco-2與HT29-MTX-E12細胞按6:1比例接種于V-ECM（絨毛-隱窩仿生界面）、F-ECM（平坦ECM界面），培養72小時形成完整上皮層。

- 細菌制備：使用大腸桿菌（E. coli）菌株（如ATCC BAA-2326™或ATCC 11303™），接種于LB瓊脂板37℃培養24小時，收集菌落并調整菌液濃度至OD???=0.01或0.1。

2. 感染模型建立與動態監測

- 感染接種：移除模型培養基，加入含大腸桿菌的培養基，共培養72小時，每24小時通過熒光顯微鏡觀察細菌與組織的互作（細菌用GFP標記，細胞用CM-Dil染色）。

- 覆蓋面積分析：利用ImageJ軟件量化GFP標記細菌在組織表面的覆蓋比例，對比V-ECM與對照組的差異。

- 屏障功能評估：通過電化學阻抗譜（EIS）測量跨上皮電阻（TEER），感染后TEER值的變化反映組織屏障完整性。V-ECM組在感染后TEER反而升高，而F-ECM組顯著下降。

3. 細菌定植與侵襲能力檢測

- 菌落計數（CFU）：收集培養介質（浮游菌）和刮取組織表面（黏附菌），梯度稀釋后接種于LB平板，計算CFU/mL。V-ECM組黏附菌數量顯著低于對照組。

- 侵襲實驗：采用慶大霉素保護法，感染后用慶大霉素殺死胞外菌，裂解細胞后培養計數，評估細菌侵襲組織的能力。V-ECM組侵襲菌比例僅為0.1%，遠低于F-ECM的3.7%。

4. 抗菌機制驗證

- 抗菌肽（AMPs）檢測：通過ELISA測定感染后組織分泌的人β-防御素2（HBD2），V-ECM組感染后HBD2分泌量顯著升高。

- 基因表達分析：RT-PCR檢測AMPs相關基因（如DEFB4A、DEFB103B）及炎癥因子（IL-1α、TNF），V-ECM組AMPs基因上調，而對照組促炎基因激活。

- 黏膜屏障觀察：Alcian Blue染色顯示V-ECM組黏膜層覆蓋面積達81.28%，而F-ECM組僅11.32%，黏液層的完整性抑制了細菌黏附。

二、抗菌藥物篩選實驗步驟

1. 耐藥菌感染模型構建

- 耐藥菌制備：將大腸桿菌轉化為卡那霉素（Kan）耐藥株（如攜帶mini-Tn7-kan-gfp質粒），調整OD???=0.1用于感染。

- 感染預處理：V-ECM模型培養72小時后，接種耐藥菌4小時，隨后更換含藥物的培養基。

2. 藥物處理與效果對比

- 藥物設置：實驗組分為T4噬菌體組（10? PFU/mL）、Kan組（100 μg/mL）及對照組（無藥）。

- 動態監測：每8小時取樣，熒光顯微鏡觀察細菌覆蓋面積，CFU計數評估細菌數量變化。T4噬菌體組24小時內細菌覆蓋從84%降至接近0，而Kan組無明顯效果。

3. 噬菌體增殖與抗菌機制分析

- 噬菌斑檢測：收集T4噬菌體處理后的培養基，梯度稀釋后接種于雙層瓊脂，觀察噬菌斑形成。24小時后噬菌斑數量增加約100倍，表明噬菌體在感染部位增殖。

- 電鏡觀察：透射電鏡（TEM）顯示T4噬菌體吸附于細菌表面并導致菌體裂解，而Kan處理組細菌膜結構完整。

- 多重感染指數（MOI）：計算噬菌體與細菌的比例，T4組MOI在24小時內從1:1升至10?:1，形成“自擴增”抗菌效應。

三、關鍵技術優勢與實驗驗證

1. 模型性能對比

2. 創新點與應用價值

- 快速篩選平臺：24小時內完成抗菌效果評估，較傳統方法（需數周）大幅縮短周期。

- 仿生機制模擬：絨毛-隱窩結構促進黏液層與AMP協同作用，更貼近體內抗菌機制。

- 耐藥菌治療潛力：噬菌體在V-ECM模型中可自我擴增，為AMR（抗微生物藥物耐藥性）感染提供新策略。

作者將 3D 仿生腸道絨毛模型應用于腸道感染建模和抗菌藥物篩選。研究人員以大腸桿菌（E. coli）為模型病原體，比較了該模型與傳統 2D 培養模型在感染過程中的差異。

實驗結果顯示，在仿生界面上培養的類器官能夠有效抵抗大腸桿菌的感染。與對照組相比，其表面的細菌定植和生物膜形成明顯減少，這主要歸因于類器官分泌的天然抗菌肽（AMPs）水平升高。進一步的機制研究表明，仿生界面的結構特征促進了杯狀細胞的分化和黏蛋白的分泌，形成了有效的黏膜屏障，從而抑制了病原體的黏附和入侵。

基于該模型的良好性能，研究人員還進行了抗菌藥物篩選實驗。他們比較了傳統抗生素卡那霉素和噬菌體 T4 對耐藥大腸桿菌的治療效果。結果顯示，噬菌體 T4 能夠在 24 小時內顯著降低細菌數量，而卡那霉素則由于細菌耐藥性而效果不佳。這一結果不僅驗證了該模型在抗菌藥物篩選中的實用性，也為耐藥菌感染的治療提供了新的思路。

四、實驗拓展與未來方向

- 微流控整合：將V-ECM模型接入英國Kirkstall Quasi Vivo器官芯片（OoC），模擬腸道蠕動流場，評估動態剪切力對感染與藥物效果的影響。

- 共培養系統：構建英國Kirkstall Quasi Vivo雙腔器官芯片（OoC），上層腸道組織+下層血管內皮細胞，研究病原體跨屏障侵襲與免疫細胞互作。

- 原代類器官驗證：使用患者來源的腸道類器官（hIOs）接種于V-ECM，提升模型臨床轉化價值。

附：超47億元！國家科技重大專項2025年項目申報指南發布（以下摘自2025.6.30“科獎中心”）

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