百歐博偉生物：制備高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是許多實(shí)驗(yàn)（如流式細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序、原代細(xì)胞培養(yǎng)等）的關(guān)鍵步驟。以下是組織單細(xì)胞懸液制備的標(biāo)準(zhǔn)流程及注意事項(xiàng)：

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、儀器與耗材

無菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子、刀片等）

細(xì)胞篩（70 μm、40 μm尼龍濾網(wǎng)）

離心管、培養(yǎng)皿、移液器

恒溫?fù)u床或水浴鍋（37℃）

離心機(jī)

2、試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS，含抗生素如青霉素/鏈霉素）

組織消化酶（根據(jù)組織類型選擇）：

膠原酶（Collagenase I/IV，適用于結(jié)締組織）

胰酶（Trypsin，適用于上皮組織）

透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，輔助消化細(xì)胞外基質(zhì)）

DNA酶（DNase I，防止DNA導(dǎo)致細(xì)胞粘連）

終止液（含血清的培養(yǎng)基或含EDTA的緩沖液）

臺(tái)盼藍(lán)（檢測(cè)細(xì)胞活性）

3、組織處理原則

保持低溫操作（冰上處理，減少細(xì)胞死亡）。

快速處理新鮮組織（離體后盡快操作）。

二、標(biāo)準(zhǔn)制備流程

1、組織取材與清洗

將組織置于預(yù)冷的PBS中，去除脂肪、血管等非目標(biāo)組織。

用PBS清洗3次，去除血液和雜質(zhì)。

2、組織剪碎

將組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用無菌剪刀剪成1-3 mm3的小塊。

加入少量PBS保持濕潤。

3、酶消化

根據(jù)組織類型選擇消化液（示例）：

實(shí)體瘤/堅(jiān)硬組織：膠原酶IV（1-2 mg/mL）+ DNase I（20 μg/mL）

脾/淋巴結(jié)：膠原酶D + 透明質(zhì)酸酶

上皮組織：胰酶-EDTA

將組織塊浸泡在消化液中，37℃振蕩消化（15-60分鐘，具體時(shí)間需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化）。

每隔10分鐘輕柔吹打一次，加速解離。

4、終止消化

加入含血清的培養(yǎng)基或EDTA緩沖液終止反應(yīng)（血清抑制胰酶活性）。

用移液器反復(fù)吹打組織懸液，直至無明顯大塊組織。

5、過濾與離心

將懸液通過70 μm細(xì)胞篩過濾，去除未消化的組織塊。

收集濾液，300-400 ×g 離心5分鐘，棄上清。

用PBS重懸細(xì)胞，再次通過40 μm濾網(wǎng)（進(jìn)一步提高單細(xì)胞率）。

6、細(xì)胞清洗與重懸

用PBS或培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，離心去除殘留酶和碎片。

重懸于適量緩沖液中（如PBS + 0.04% BSA）。

7、細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性檢測(cè)

臺(tái)盼藍(lán)染色法：活細(xì)胞率需 >85%（若活性低，可優(yōu)化消化時(shí)間或酶濃度）。

調(diào)整細(xì)胞濃度至目標(biāo)值（如1×10? cells/mL）。

三、不同組織類型的注意事項(xiàng)

1、實(shí)體瘤

可能需要機(jī)械輔助（如用注射器反復(fù)吹打或輕柔研磨）。

使用復(fù)合酶（如膠原酶 + 分散酶 Dispase）。

2、脾臟/淋巴結(jié)

可直接機(jī)械研磨（用注射器活塞壓碎），無需長時(shí)間酶消化。

3、肝臟/腎臟

膠原酶消化后需多次洗滌去除肝細(xì)胞碎片。

4、腦組織

使用低濃度胰酶（0.25%）+ DNase，避免過度消化神經(jīng)元。

四、常見問題與解決方案

五、質(zhì)量控制

顯微鏡觀察：確認(rèn)細(xì)胞為單個(gè)分散，無明顯團(tuán)塊或碎片。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：通過前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）評(píng)估細(xì)胞均一性。

功能性驗(yàn)證：根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞培養(yǎng)、染色）結(jié)果反向優(yōu)化流程。

通過以上步驟，可高效制備高質(zhì)量單細(xì)胞懸液，為下游實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。不同組織需靈活調(diào)整方案，建議通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定條件。

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