在生物醫(yī)學(xué)及食品營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域，羥基抗氧化能力（Hydroxyl Antioxidant Capacity, HORAC）作為評(píng)估物質(zhì)抗氧化性能的關(guān)鍵指標(biāo)之一，其檢測(cè)方法和應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。HORAC 檢測(cè)試劑盒憑借其精準(zhǔn)的檢測(cè)原理和便捷的操作流程，為科研工作者提供了有力的工具。

HORAC 檢測(cè)的背景與目的

HORAC 檢測(cè)主要用于衡量樣本對(duì)羥基自由基（·OH）的 scavenging 能力。羥基自由基是一種具有活性的氧自由基，能夠引發(fā)脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷以及蛋白質(zhì)變性等過程，從而參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制。因此，準(zhǔn)確評(píng)估物質(zhì)的 HORAC 對(duì)于研究其抗衰老、防疾病等生物活性具有重要意義。同時(shí)，HORAC 檢測(cè)還可用于食品工業(yè)中，幫助開發(fā)具有高抗氧化能力的食品，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，保障食品安全。

HORAC 檢測(cè)的原理剖析

HORAC 檢測(cè)基于自由基鏈反應(yīng)的終止原理。在檢測(cè)體系中，通常使用 Fenton 反應(yīng)（Fe2? + H?O? → Fe3? + ·OH + OH?）來生成羥基自由基。這些羥基自由基會(huì)進(jìn)一步與探針分子（如鄰二氮菲 - 鐵絡(luò)合物）發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致探針的氧化和熒光信號(hào)的變化。當(dāng)樣本中的抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，它們會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地 scavenging 羥基自由基，從而抑制探針的氧化反應(yīng)，減少熒光信號(hào)的損失。通過測(cè)定熒光信號(hào)的變化程度，即可計(jì)算出樣本的羥基抗氧化能力。

具體來說，熒光探針的選擇和優(yōu)化是 HORAC 檢測(cè)的關(guān)鍵。鄰二氮菲 - 鐵絡(luò)合物是一種常用的探針，它在還原態(tài)時(shí)具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，而在被羥基自由基氧化后熒光強(qiáng)度顯著下降。為了提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，研究人員不斷探索新型熒光探針，如一些基于熒光素或羅丹明的探針，它們對(duì)羥基自由基具有更高的響應(yīng)速度和選擇性。此外，探針的濃度、激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)等參數(shù)都需要精確優(yōu)化，以確保檢測(cè)信號(hào)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

HORAC 檢測(cè)的關(guān)鍵步驟

樣本制備是 HORAC 檢測(cè)的第一步，也是確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)。對(duì)于生物樣本，如血漿、組織勻漿等，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯统鞍滋幚怼Ｏ♂尡稊?shù)應(yīng)根據(jù)樣本中抗氧化物質(zhì)的大致含量確定，以使最終檢測(cè)信號(hào)處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。除蛋白步驟通常采用超濾或沉淀法，以避免蛋白質(zhì)對(duì)熒光信號(hào)的干擾。對(duì)于食品樣本，則需要進(jìn)行提取和過濾，提取溶劑的選擇應(yīng)基于目標(biāo)抗氧化物質(zhì)的極性和溶解性。例如，使用甲醇或乙醇提取多酚類化合物，使用超純水提取水溶性維生素等。

體系構(gòu)建與反應(yīng)監(jiān)測(cè)是 HORAC 檢測(cè)的核心環(huán)節(jié)。在構(gòu)建反應(yīng)體系時(shí)，需要精確控制 Fenton 反應(yīng)的條件，包括 Fe2?和 H?O?的濃度、pH 值和反應(yīng)溫度等。Fe2?濃度過高可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)，而濃度過低則會(huì)使羥基自由基生成不足。H?O?的濃度則影響自由基生成的速率和數(shù)量。反應(yīng)體系的 pH 值通常維持在 7.0 - 7.4 之間，以模擬生理?xiàng)l件并確保探針和抗氧化物質(zhì)的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度一般設(shè)定在 37℃左右，以加速反應(yīng)進(jìn)程并提高檢測(cè)效率。

熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)采用熒光光譜儀進(jìn)行。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇應(yīng)根據(jù)所用探針的光譜特性確定。對(duì)于鄰二氮菲 - 鐵絡(luò)合物，激發(fā)波長(zhǎng)通常為 490 nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng)為 520 nm 左右。在反應(yīng)過程中，每隔一定時(shí)間（如 30 秒）記錄一次熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度 - 時(shí)間曲線。曲線的斜率反映了羥基自由基與探針反應(yīng)的速率，而樣本的存在會(huì)使斜率減小，減小程度與樣本的 HORAC 呈正相關(guān)。

數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析是獲得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。首先，需要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行背景校正，扣除空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度，以消除體系自發(fā)熒光和儀器噪聲的影響。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用一系列已知 HORAC 值的標(biāo)準(zhǔn)品（如 Trolox）進(jìn)行檢測(cè)，以熒光強(qiáng)度變化率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，建立線性回歸方程。最后，將樣本的熒光強(qiáng)度變化率代入方程，計(jì)算出樣本的 HORAC 值，并以 Trolox 當(dāng)量（TE）表示。

HORAC 檢測(cè)的應(yīng)用實(shí)例

在生物醫(yī)學(xué)研究中，HORAC 檢測(cè)可用于評(píng)估藥物、保健品和天然產(chǎn)物的抗氧化活性。例如，在研究某種中藥提取物的抗衰老作用時(shí)，通過 HORAC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該提取物具有顯著的羥基自由基 scavenging 能力，其 HORAC 值與已知的抗氧化藥物相當(dāng)。這為該中藥提取物的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。此外，HORAC 檢測(cè)還可用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程和治療效果。在某些氧化應(yīng)激相關(guān)疾病（如心血管疾病、糖尿病等）患者的血漿樣本中，HORAC 值通常較低。通過治療干預(yù)，如給予抗氧化劑藥物或調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，患者的 HORAC 值可能會(huì)有所提高，從而反映治療的有效性。

在食品營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域，HORAC 檢測(cè)可用于食品品質(zhì)評(píng)價(jià)和功能食品開發(fā)。例如，對(duì)不同品種的水果和蔬菜進(jìn)行 HORAC 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)某些深色水果（如藍(lán)莓、黑莓）和綠葉蔬菜（如菠菜、西蘭花）具有較高的 HORAC 值，這與其富含的多酚、類黃酮等抗氧化成分有關(guān)。這些食品可被推薦為健康食品，用于日常飲食中的抗氧化攝入。此外，食品加工過程中，HORAC 檢測(cè)可用于評(píng)估加工方法（如加熱、干燥、發(fā)酵等）對(duì)食品抗氧化能力的影響，從而優(yōu)化加工工藝，保留食品中的抗氧化成分。