一、背景

兔主動脈平滑肌細胞分離自主動脈組織，是一種常用的細胞模型，用于研究動脈粥樣硬化。它們通常在培養皿中培養，使用DMEM高糖培養基、10%胎牛血清和1%雙抗。

兔主動脈平滑肌細胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯合消化法結合差速貼壁法制備而來，兔主動脈平滑肌細胞分離自主動脈組織；主動脈是體循環的動脈主干。

其運行路徑為：升主動脈起于左心室，至右側第2胸肋關節高度移行為主動脈弓，弓行向左后至第4胸椎體下緣移行為降主動脈；在第12胸椎體高度穿膈的主動脈裂孔移行為腹主動脈，以上為胸主動脈，至第4腰椎體下緣分為左、右髂總動脈；髂總動脈在骶髂關節高度分為髂內、外動脈。主動脈平滑肌細胞原代分離培養3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態大小不一，呈梭形、不規則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區域多層重疊生長，高低起伏；

細胞密度低時，常交織成網狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態學特征和生長特點。

主動脈平滑肌細胞在心血管疾病發生、發展中具有重要作用，以主動脈平滑肌細胞為實驗研究對象，探討心血管疾病相關發病機制是目前研究的熱點；體外培養的主動脈平滑肌細胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

二、應用

兔主動脈平滑肌細胞可以用于鈣感受器STIM1參與主動脈平滑肌細胞衰老的作用機制研究：

在氧化應激誘導的衰老VSMCs模型及自然衰老的動物模型中,觀察STIM1是否參與主動脈平滑肌細胞衰老進程,及其相關作用機制。

方法：使用200μM過氧化氫溶液(H2O2)處理人主動脈平滑肌細胞(Human aorta vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs)2h構建氧化應激衰老VSMCs模型;C57BL/6分別飼養至3月齡、12月齡、18月齡,建立自然衰老動物模型;Cre-lox P基因重組技術構建平滑肌特異性STIM1敲除小鼠(smc STIM1-/-)模型;采用衰老相關β-半乳糖苷酶染色檢測衰老VSMCs陽性率;Western blot檢測細胞或組織中鈣池操縱性鈣通道(store-operated calcium channel,SOC)相關蛋白STIM1、STIM2、ORAI1表達水平、衰老相關標記蛋白蛋白p53、p21、p16及自噬相關蛋白p62、LC3B等表達水平;激光共聚焦測鈣技術檢測單個細胞的SOCE的鈣信號變化,微血管張力測定技術檢測收縮劑誘導的及SOC介導的血管收縮功能;轉錄組高通量測序技術檢測STIM1敲除對主動脈平滑肌轉錄水平的變化。透視電鏡檢測STIM1敲除對小鼠主動脈平滑肌超微結構的影響;m RFP-GFP-LC3串聯熒光蛋白系統檢測細胞自噬流變化;流式細胞儀檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。

結果：

(1)在H2O2誘導的衰老VSMCs模型上,衰老相關蛋白p21、p16表達上調,衰老相關β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率增加,伴STIM1及ORAI1蛋白表達下調,SOCE水平降低;

(2)老齡小鼠(12月齡、18月齡)主動脈組織SOC相關蛋白STIM1和ORAI1表達下調,以及SOC通道介導的血管收縮反應下降；

(3)smc STIM1-/-小鼠主動脈組織中STIM1水平下降,而STIM2及ORAI1蛋白表達無明顯差異,SOC介導的收縮反應幾乎消失,不同濃度的Phe誘導的血管收縮無明顯差異,然而在硝苯地平預處理后,有或無細胞外鈣條件下血管收縮幾乎消失;

(4)smc STIM1-/-小鼠主動脈衰老相關蛋白p53、p21及p16均上調,sh STIM1下調細胞STIM1表達,并伴隨著衰老相關蛋白p53、p21及p16表達以及ROS水平的增加;

(5)smc STIM1-/-小鼠主動脈組織轉錄組高通量測序顯示下調基因富集在自噬與線粒體自噬中;

(6)smc STIM1-/-小鼠主動脈組織,超微結構下線粒體腫脹、嵴消失,線粒體面積及長度顯著增加,線粒體分裂相關蛋白FIS1顯著下調,線粒體融合蛋白MFN2表達上調,自噬相關蛋白PINK1、Parkin表達下調,p62表達上調;

(7)sh STIM1下調細胞STIM1表達后,自噬相關蛋白p62、LC3BII表達上調,進一步使用HCQ處理后,sh STIM1+HCQ組LC3BII表達量不高于sh NC+HCQ組。

(8)m RFP-GFP-LC3串聯熒光蛋白系統檢測,提示氧化應激衰老VSMCs模型自噬小體數量顯著增多,而自噬溶酶體數量增加不變;在衰老VSMCs模型中過表達STIM1導致自噬溶酶體數量顯著增多,并比自噬小體數量多,HCQ處理可逆轉該過程。

(9)過表達STIM1能夠減少衰老VSMCs p21、p16表達以及ROS水平上調,以及衰老相關β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率增加,且HCQ處理后被逆轉。

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