一、知識(shí)簡(jiǎn)介

皺褶假絲酵母(Candida rugosa)，舊稱柱狀假絲酵母(Candida cylindracea)，是一種半子囊無(wú)孢子、假絲狀、單細(xì)胞、非致病的酵母菌。該酵母通常被認(rèn)為是對(duì)人類和其它生命形式都是安全的。

在巧克力的生產(chǎn)過(guò)程中，皺褶假絲酵母起到了很大的作用。它能將種子內(nèi)的這些糖轉(zhuǎn)化為乙醇，并分解果膠質(zhì)。

二、基本信息

中文名：皺褶假絲酵母

外文名：Candidarugosa

原名：柱狀假絲酵母

特征：半子囊無(wú)孢子、假絲狀、單細(xì)胞

應(yīng)用：生產(chǎn)脂肪酶

致病性：非致病

三、菌株定義

皺褶假絲酵母(C. rugosa)，原名柱狀假絲酵母(C. cylindracea)，是一種半子囊不產(chǎn)孢子的假絲狀單細(xì)胞非致病酵母真菌。該酵母通常被認(rèn)為是對(duì)人類和其它生命形式都是安全的。其所產(chǎn)的脂肪酶（C. rugosa lipase , CRL）廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)與現(xiàn)代工業(yè)，如脂肪酸的生產(chǎn)、各種酯類的合成等，是當(dāng)前世界上應(yīng)用泛的商品化脂肪酶之一。

另外，在巧克力的生產(chǎn)過(guò)程中，皺褶假絲酵母起到了很大的作用。可可樹(shù)的種子內(nèi)含有大量的糖，非常適合皺褶假絲酵母的生長(zhǎng)。它能將種子內(nèi)的這些糖轉(zhuǎn)化為乙醇，并分解果膠質(zhì)。如果沒(méi)有皺褶假絲酵母的參與，最終的產(chǎn)品是非常苦澀的。最終，皺褶假絲酵母會(huì)由于高濃度的醇而死亡，可可豆經(jīng)過(guò)一些后續(xù)化處理如干燥，包裝得到最終的產(chǎn)品。

四、脂肪酶分子量

大多數(shù)微生物脂肪酶分子量在 30-40 kDa 之間，而 C. rugosa 脂肪酶（CRL）和Geotrichum candidum 脂肪酶（GCL）分子量較大，約 60 kDa。CRLs 和 GCLs 是一類與膽堿酯酶（cholinesterase）結(jié)構(gòu)類似的脂肪酶，都具有 α/β 水解酶的折疊結(jié)構(gòu)和Ser-His-Glu 三聯(lián)體催化中心。隨著脂肪酶的純化及基因克隆與表達(dá)研究的深入，發(fā)現(xiàn)兩種屬脂肪酶均存在基因多態(tài)性現(xiàn)象，在 C. rugosa 中發(fā)現(xiàn)至少有 7 種脂肪酶同工酶，G. candidum 為 2 種，這些同工酶在一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上都存在差異。工業(yè)上廣泛用作催化劑的 GCL 和 CRL 大多是混有幾種同工酶的粗酶。

五、研究進(jìn)展

1990 年，有研究報(bào)道了 C. rugosa lip1 的突變體核酸序列，到目前為止，先后從 C. rugosa 克隆出 8 個(gè)脂肪酶基因，研究者通過(guò) Southern 雜交從 C. rugosa 基因組文庫(kù)中分別得到 lip1~lip5 全長(zhǎng)核酸序列，并預(yù)測(cè) lip6 和 lip7 基因。其中 lip1、lip3、lip4 和 lip5 基因序列全長(zhǎng)為 1650 bp，lip2 基因序列全長(zhǎng)為 1647 bp。研究發(fā)現(xiàn)這些同工酶的基因均不含內(nèi)含子，基因定位在 C. rugosa 的 I 號(hào)染色體上，成熟的脂肪酶包含 534 個(gè)氨基酸，分子量約為 60 kDa，等電點(diǎn)在 4.5~6.0 之間，具有不同的糖基化程度和底物特異性，但是基因的同源性高達(dá) 70%。隨后 Xu 等從 C.rugosa (ATCC14830) 菌株中克隆得到 lipJ08 基因，全長(zhǎng) 1650 bp，編碼 549 個(gè)氨基酸，其中包含一個(gè) 15 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，成熟的脂肪酶包含 534 個(gè)氨基酸，與該菌株同工酶的一級(jí)序列比對(duì)，同源性高達(dá) 89%。研究發(fā)現(xiàn) C. rugosa 不遵循常用的密碼子系統(tǒng)，通常編碼亮氨酸的密碼子 CTG，在 C. rugosa 中編碼絲氨酸 (Ser) ，包括在 CRL各組分中的催化位點(diǎn) Ser209 也是由 CTG 編碼。因此，C. rugosa 脂肪酶基因直接異源表達(dá)，得到的是無(wú)活性的蛋白。為解決這個(gè)問(wèn)題，可以選擇密碼子使用模式相同的微生物作為宿主菌株或者將非常規(guī)密碼子 CTG 改為 TCT 再進(jìn)行異源表達(dá)。Brocca等用全基因合成方法將密碼子 CTG 突變?yōu)?TCN，其中包括催化位點(diǎn)Ser209，合成了的 lip1 基因，并在 Saccharomyces cerevisiae 和 Pichia pastoris 中異源表達(dá)，都得到有活性的蛋白，且轉(zhuǎn)入 P. pastoris 的轉(zhuǎn)化子在 1-L 搖瓶中 pH 6.0 條件下，發(fā)酵 280 h 酶活達(dá)到 150 U/mL，且對(duì) C8 和 C10 長(zhǎng)度的脂類顯示較高的水解活力。

隨后 Tang 等采用重疊延伸 PCR 技術(shù)將 lip4 基因中 19 個(gè)編碼絲氨酸的密碼子 CTG 進(jìn)行改造，分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。lip4 有一個(gè)皺褶假絲酵母脂肪酶糖基化位點(diǎn) Asn-351，在畢赤酵母中表達(dá)的重組酶經(jīng)過(guò)糖基化后，熱穩(wěn)定從 52 °C 升至 58 °C，但是催化性質(zhì)與大腸桿菌中表達(dá)的產(chǎn)物沒(méi)有明顯差異。對(duì)兩種重組脂肪酶活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)鏈酯(C16 和 C18)有較高的酯活力，對(duì)不飽和的長(zhǎng)鏈脂肪也有較高的活性。

2002 年，Lee 等克隆 C.rugosa 的脂肪酶 lip2 基因利用 Overlap extension PCR技術(shù)將該基因中的 17 個(gè)編碼絲氨酸的 CTG 密碼子突變?yōu)?TCT，在 P. pastorisSMD168H 成功表達(dá)。該酶 pH 為 7.0，在溫度為 30~50 °C，對(duì) C12~C16 的對(duì)硝基苯酯有較高的水解活力，轉(zhuǎn)酯和醇酯化的底物分別是丁酸和 C18。同時(shí)，對(duì)三丁酸甘油脂和十二酸膽固醇酯活性。Ferrer 等將 lip2 用 AOX 作為啟動(dòng)子在畢赤酵母中異源表達(dá)，重組酶 LIP2 的表達(dá)量比原始 C.rugosa 菌株發(fā)酵 LIP2產(chǎn)量提高了 10 倍。

2005 年，Chang 等人應(yīng)用 RT-PCR 技術(shù)從 C.rugosa(X64703)菌株基因組中克隆 lip1 基因，利用 Overlap extension PCR 技術(shù)將該基因的成熟肽 19 個(gè)編碼絲氨酸的CTG 密碼子突變?yōu)?TCT，以 P. pastoris KM71 作為宿主菌株，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后，以三丁酸甘油酯為底物，酶活力為 253.3 U/mL。

2006 年，Chang 等將 lip3 中 18 個(gè)編碼絲氨酸的 CTG 密碼子用重疊延伸 PCR技術(shù)定點(diǎn)突變?yōu)?TCT；同時(shí)將 5’端 339 個(gè)堿基進(jìn)行密碼子優(yōu)化，改造后的兩段基因在畢赤酵母中表達(dá)出有活性的蛋白，密碼子優(yōu)化后表達(dá)的重組酶活力比未優(yōu)化的提高 1.44 倍。重組脂肪酶的溫度范圍為 20~50 °C，pH 4.0~6.0，對(duì) C8~C12的 pNP 酯有較高的水解活力。

2011 年，Lee 等將 lip5 基因的 16 個(gè)編碼絲氨酸的 CTG 密碼子定點(diǎn)突變，在畢赤酵母中表達(dá)。重組 LIP5 在反應(yīng)溫度為 50 °C， pH 為 8.0。研究底物特異性發(fā)現(xiàn)，重組酶對(duì)短鏈 pNP 酯(C4)、丁酰輔酶 A (C4)有較高的水解活性， LIP5與 LIP4 和 LIP2 都對(duì)短鏈底物有較好的水解作用。

六、脂肪酶應(yīng)用

皺褶假絲酵母脂肪酶可以催化水解、醇解、轉(zhuǎn)酯和酯化等多種反應(yīng)，根據(jù)該酶的不同特性應(yīng)用于工業(yè)的不同領(lǐng)域。CRLs 對(duì)甘油三酯中的 Sn-2 和 Sn-1/3 位酯鍵的識(shí)別和水解具有不同選擇特異性且對(duì)底物的立體對(duì)映結(jié)構(gòu) 1 位和 3 位酯鍵的表現(xiàn)出較高的識(shí)別特異性和對(duì)映選擇性，因此，常用于制備對(duì)映體有機(jī)化合物，藥物手性拆分，外消旋醇和酯的動(dòng)力學(xué)拆分和催化合成大量藥品，例如催化合成有光學(xué)活性的非甾醇類抗炎藥(苯酮苯丙酸、萘普生、布洛芬)，生物堿類的光學(xué)異構(gòu)體合成、抗生素、二級(jí)醇、生化抑制劑和前藥等。Chen 等固定化 C. rugosa 脂肪酶后在環(huán)己烷中合成了(S)－布洛芬酯。利用 C. rugosa 脂肪酶對(duì)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸催化活性低這一特性，可以從魚油中生產(chǎn) EPA 和 DHA。除此以外，皺褶假絲酵母脂肪酶還被廣泛應(yīng)用于生物傳感器、生物材料、生物降解和生物識(shí)別等領(lǐng)域中。

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