一、細胞特性與應用價值

永生化大鼠門靜脈肌成纖維細胞（RGF）是經基因工程改造后獲得永生化特性的細胞系。這些細胞不僅保留了正常肌成纖維細胞的收縮、分泌等基礎功能，還具備持續增殖能力，為肝臟疾病研究等提供穩定細胞模型。在肝臟纖維化與再生領域，RGF細胞可用于探究肌成纖維細胞激活及參與組織修復機制，助力了解肝臟損傷后的病理生理變化。同時，它們也是藥物篩選與毒性測試的優質體外模型，能快速評估藥物對肌成纖維細胞生理功能的影響，為肝臟疾病藥物研發提供實驗依據。

二、細胞培養前的準備工作

（一）培養設備與器材檢查

在進行細胞培養之前，對培養設備和器材進行全面檢查是確保實驗順利進行的關鍵步驟。首先檢查細胞培養箱，確認其溫度、濕度和 CO? 濃度的控制系統是否正常。一般來說，細胞培養箱的溫度應精準維持在 37℃，濕度需保持在 95% 左右，而 CO? 濃度則應穩定在 5%。這三個參數對于模擬細胞在體內的生長環境至關重要。如果發現培養箱的任何參數出現偏差，應立即進行校準或維修，以確保細胞能夠在適宜的環境中生長。

顯微鏡是觀察細胞形態和生長狀態的工具。檢查顯微鏡的目鏡和物鏡是否清潔無污，調節焦距的裝置是否靈活有效。只有通過清潔且功能正常的顯微鏡，才能清晰準確地觀察到細胞的細微結構，如細胞核的形狀、細胞質的分布以及細胞間的連接情況等，從而及時發現細胞生長過程中的異常變化。此外，還需檢查培養皿、離心管等耗材的質量。確保培養皿表面平整光滑、無劃痕、無裂紋，離心管密封性能良好、無破損。使用前，對所有耗材進行高壓滅菌處理（121℃，15 - 20 分鐘）或直接使用無菌包裝的一次性耗材，以防止細菌、真菌等微生物污染細胞，影響實驗結果。

（二）培養基配制與滅菌

配制適合 RGF 細胞生長的培養基是細胞培養成功的另一個關鍵因素。基礎培養基通常選擇 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM），這些培養基含有細胞生長所需的基本營養成分，如碳水化合物、氨基酸和維生素等。除了基礎培養基外，還需添加 10% - 15% 的胎牛血清（FBS），胎牛血清富含多種細胞生長因子、激素和黏附因子，能夠為細胞提供豐富的營養支持，促進細胞的生長和增殖。同時，加入青霉素 - 鏈霉素溶液（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）以防止細菌和真菌的污染。

配制好的培養基需要進行高壓蒸汽滅菌處理。將培養基分裝到合適的容器中，設置壓力為 100 - 105 kPa，溫度為 121℃，滅菌 15 - 20 分鐘。在滅菌過程中，要確保培養基不過度沸騰，以免造成成分的丟失或變性。滅菌完成后，將培養基調至 4℃保存，待使用前再恢復至室溫，以保持培養基中各種成分的穩定性和活性。

三、細胞復蘇的規范操作

從凍存狀態復蘇 RGF 細胞是細胞培養的起始步驟，正確的操作可以確保細胞的活性和正常生長。首先，準備一個 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中，并用鑷子快速搖動凍存管，使細胞在 1 - 2 分鐘內全融化。快速融化可以最大限度地減少細胞在低溫到常溫過程中受到的損傷，提高細胞的復蘇率。

然后，用 75% 的酒精對凍存管外部進行消毒，以防止外界細菌、真菌等微生物污染細胞。在無菌操作臺內，將凍存管內的細胞懸液快速加入到含有適量培養基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散在培養基中。接下來進行離心操作，一般設定離心速度為 1000 - 1200rpm，離心時間為 5 分鐘左右，使細胞沉淀到離心管底部。離心完成后，小心棄去上清液，注意不要倒掉沉淀的細胞。加入新鮮的培養基，用移液管輕輕吹打細胞沉淀，使其重新懸浮在培養基中。將細胞懸液轉移至培養皿中，輕輕晃動培養皿，使細胞均勻分布在整個培養皿表面，放入 37℃、5% CO? 的細胞培養箱中靜置培養，讓細胞逐漸恢復活性并開始貼壁生長。在復蘇后的 24 小時內，要密切觀察細胞的生長狀態，及時更換培養基，以確保細胞能夠順利適應新的培養環境。

四、細胞培養過程中的觀察與記錄

定期觀察 RGF 細胞的生長狀態是細胞培養過程中的重要環節。通常每天至少觀察一次細胞，觀察內容包括細胞的形態、顏色、細胞密度以及培養基的情況等。正常生長的 RGF 細胞呈梭形或紡錘形，細胞邊緣清晰，胞質均勻，顏色為淡黃色或透明，細胞之間相互連接成網狀結構。當細胞生長良好時，細胞密度會逐漸增加，培養基的顏色可能會因為細胞代謝而略有變化，如由紅色逐漸變為橙色或淡黃色。

若觀察到細胞顏色變深、渾濁，或者出現大量漂浮物，則可能提示細胞受到細菌、真菌或支原體等微生物的污染，或者細胞已經死亡、變性。此時需要立即進行處理，如更換培養基、使用抗生素等，嚴重污染的細胞可能需要丟棄，以防止污染擴散到其他細胞培養體系中。

同時，要詳細記錄細胞的生長情況，包括細胞的形態變化、細胞密度的估計值（如以細胞占據培養皿面積的百分比表示）、培養基的更換時間、細胞傳代的時間和比例等信息。這些記錄有助于了解細胞的生長規律，為后續實驗安排提供參考，也有助于在出現問題時追溯原因，及時調整培養條件或采取相應的解決措施。例如，通過觀察細胞在不同培養基成分下的生長情況，可以優化培養基配方，提高細胞的生長質量和實驗重復性。

五、細胞傳代的詳細步驟

當 RGF 細胞生長到培養皿面積的 80% - 90% 左右時，需要進行傳代操作，以避免細胞因密度過高而出現接觸抑制，影響細胞的正常生長和功能。傳代前，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗培養皿中的細胞，目的是去除細胞表面殘留的培養基和一些可能影響細胞傳代的雜質。沖洗時，將適量的 PBS 緩慢加入培養皿，輕輕晃動培養皿使 PBS 均勻覆蓋細胞表面，然后將 PBS 緩慢傾斜倒出，注意不要用力沖刷細胞，以免對細胞造成損傷。

接著，加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培養皿中，胰蛋白酶可以分解細胞間的黏附分子，使細胞從培養皿表面脫落。將培養皿放入 37℃、5% CO? 的培養箱中孵育 1 - 2 分鐘，期間要不時在顯微鏡下觀察細胞是否開始脫落。若細胞未全脫落，可輕輕敲擊培養皿的側壁，幫助細胞脫離培養皿表面。當細胞大部分脫落形成細胞懸液后，立即加入適量的含血清培養基終止胰蛋白酶的作用，因為胰蛋白酶作用時間過長會對細胞造成損傷，影響細胞的活性和后續生長。

將細胞懸液轉移至離心管中，進行離心（條件同前），棄去上清液后，加入新鮮的培養基，用移液管輕輕吹打，使細胞均勻分散在培養基中。按照適當的比例（如 1:2 或 1:3）將細胞懸液分配到新的培養皿中，輕輕晃動培養皿使細胞均勻分布，放入培養箱繼續培養。傳代后的細胞需要特別關注前 24 小時的生長狀態，觀察細胞是否能夠正常貼壁、恢復生長，如有異常及時采取措施，如調整培養基成分、優化培養條件等，以確保細胞的健康生長和實驗的順利進行。

六、細胞凍存的標準化流程

對于多余的細胞或需要長期保存的細胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，先用胰蛋白酶消化細胞并收集細胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細胞均勻分散在凍存液中。將細胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，使細胞緩慢降溫。如果沒有程序降溫盒，可采用手動降溫的方法：先將凍存管放置在 4℃環境下 30 分鐘，再轉移到 - 20℃環境下放置 1 - 2 小時，最后轉移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小時，之后迅速將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。這種緩慢降溫的程序可以減少細胞內冰晶的形成，降低細胞在凍存過程中受到的損傷，提高細胞的復蘇率。在凍存過程中，要注意保持凍存管的密封性，防止水分進入導致細胞受損，同時做好凍存管的標記，注明細胞名稱、凍存日期等信息，以便后續使用時能夠快速準確地找到所需的細胞。

七、細胞實驗應用的操作要點

（一）細胞遷移與侵襲實驗操作

RGF 細胞在肝臟纖維化等病理過程中涉及細胞遷移和侵襲行為。細胞遷移與侵襲實驗可用于研究影響細胞運動能力的各種因素。常用的實驗方法有 Transwell 小室實驗和劃痕實驗。

在 Transwell 小室實驗中，上層小室的底部鋪有一層聚碳酸酯膜，該膜上可以涂有或不涂有細胞外基質成分（如膠原蛋白、纖維連接蛋白等），以模擬體內細胞遷移的微環境。下層小室中加入含有一定濃度細胞因子或藥物的培養基作為化學趨向因子，吸引上層小室中的細胞向下游遷移或侵襲。將 RGF 細胞種植到上層小室中，放入培養箱孵育一定時間（如 12 - 24 小時）。孵育結束后，用棉簽輕輕擦去上層小室表面未遷移或侵襲的細胞，對遷移或侵襲至下層小室或膜下表面的細胞進行固定、染色，然后在顯微鏡下計數。通過比較不同實驗組和對照組的遷移或侵襲細胞數量，可以評估各種因素對細胞運動能力的影響。

劃痕實驗則是在細胞鋪滿培養皿后，用無菌的細尖頭物在細胞層上劃痕，制造出細胞空白區域。隨后用 PBS 輕洗，去除劃痕邊緣的懸浮細胞。將培養皿置于培養箱中孵育，不同時間點取出觀察并拍照，記錄細胞遷移填補劃痕的情況。通過測量劃痕寬度的變化或計算遷移細胞的數量，可以定量分析細胞的遷移能力。

（二）細胞因子分泌檢測實驗操作

RGF 細胞會分泌多種細胞因子，在調節細胞行為、免疫反應等方面起著重要作用。通過檢測 RGF 細胞分泌的細胞因子，可以深入了解其在不同刺激條件下的功能狀態。常用的細胞因子檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質芯片等。

在進行 ELISA 檢測時，首先根據實驗需求選擇合適的細胞因子檢測試劑盒，如檢測大鼠 TGF - β（轉化生長因子 - β）或 PDGF（血小板衍生生長因子）等細胞因子。將 RGF 細胞培養至一定密度后，用不含血清的培養基孵育細胞一段時間（如 24 - 48 小時），收集上清液作為待測樣本。按照試劑盒說明書的操作步驟，將樣本加入到預先包被有特異性抗體的酶標板孔中，經過孵育、洗滌、加入酶標記二抗、顯色反應等步驟，最后通過酶標儀測定吸光度值，根據標準曲線計算出細胞因子在樣本中的濃度。通過比較不同處理組和對照組的細胞因子分泌水平，可以分析各種因素（如藥物、炎癥因子等）對 RGF 細胞分泌功能的影響，從而探討其在肝臟疾病發生發展中的作用機制，為開發新的治療策略提供線索。

（三）細胞與材料相互作用實驗操作

在組織工程研究中，研究 RGF 細胞與生物材料的相互作用是一個關鍵環節。將 RGF 細胞種植到不同的生物材料表面（如生物可降解材料、組織工程支架等），可以觀察細胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及細胞外基質分泌等情況，從而評估材料的生物相容性和對組織修復的支持作用。

在進行這類實驗時，首先需要對生物材料進行適當的處理和滅菌，確保材料表面清潔、無毒且適合細胞生長。將材料樣品放置在培養皿或細胞培養板中，然后將細胞以適當的密度接種到材料表面。在細胞培養箱中孵育一段時間后，通過掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料表面的形態和分布情況，了解細胞與材料的初始黏附狀態。同時，可以采用一系列的細胞生物學檢測方法，如細胞計數試劑盒（CCK - 8）檢測細胞的增殖情況，免疫熒光染色檢測細胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相關分化標志蛋白的表達等，綜合評估細胞與材料之間的相互作用效果。通過這些實驗，可以篩選出適合組織工程應用的生物材料，優化材料的表面特性或組成，以提高細胞的活性和功能，加速組織的修復和再生過程。