百歐博偉生物：細胞自噬（autophagy）的染色實驗通常依賴于熒光探針或抗體標記，以觀察自噬體（autophagosome）或溶酶體（lysosome）的動態變化。以下是幾種常用的細胞自噬染色實驗步驟，包括MDC染色、LysoTracker染色和自噬檢測試劑盒等方法。

一、MDC（Monodansylcadaverine）染色

原理：MDC是一種疏水性熒光染料，可選擇性標記自噬體膜的脂雙層結構。

步驟：

細胞處理：

將細胞接種于共聚焦培養皿或細胞爬片中，待其貼壁后，進行自噬誘導或抑制。

染色：

配制MDC工作液（終濃度50 μM，用無血清培養基或PBS稀釋）。

吸去原培養基，加入MDC工作液，37℃避光孵育15-30分鐘。

洗滌：

吸去染色液，用預熱的PBS輕柔洗滌細胞3次（每次5分鐘），去除未結合的染料。

觀察：

立即用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察（激發波長335 nm，發射波長525 nm）。

注意：MDC染色需活細胞觀察，避免固定（固定會破壞自噬體結構）。

二、LysoTracker染色（溶酶體標記）

原理：LysoTracker標記酸性細胞器，用于觀察自噬體與溶酶體融合。

步驟：

細胞處理：

同MDC步驟，誘導或抑制自噬后，準備染色。

染色：

將LysoTracker Red或 Green（終濃度50-100 nM）用培養基稀釋，避光條件下37℃孵育30分鐘。

洗滌：

用PBS洗滌3次，去除多余染料。

固定（可選）：

若需固定，用4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌后封片。

注意：LysoTracker適用于活細胞或固定后細胞，但固定可能影響溶酶體酸性環境。

三、CYTO-ID® 自噬檢測試劑盒（特異性標記自噬體）

原理：CYTO-ID® 是一種綠色熒光染料，特異性標記自噬體膜，不與溶酶體結合。

步驟（以試劑盒說明書為準，以下為通用流程）：

細胞處理：

誘導或抑制自噬后，用預熱的PBS洗滌細胞1次。

染色：

加入CYTO-ID® 染色液（1:1000稀釋于培養基或緩沖液），37℃避光孵育30分鐘。

洗滌：

用1× Assay Buffer洗滌2次，每次5分鐘。

核染色（可選）：

加入33342（1 μg/mL）染色5分鐘。

觀察：

熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測（CYTO-ID® Ex/Em=480/530 nm）。

優勢：適用于活細胞、高特異性、可定量分析。

四、免疫熒光染色（LC3抗體標記）

原理：通過抗體標記LC3蛋白（自噬體標志物），區分LC3-I（胞質）和LC3-II（自噬體膜結合形式）。

步驟：

細胞處理：同前。

固定：4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌。

透化：0.1% Triton X-100處理10分鐘，PBS洗滌。

封閉：5% BSA封閉1小時。

一抗孵育：抗LC3抗體（1:200-1:500稀釋）4℃過夜。

二抗孵育：熒光標記二抗，避光室溫1小時。

核染色：DAPI（1 μg/mL）染色5分鐘。

封片觀察：抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡觀察LC3 puncta（斑點狀結構）。

五、注意事項

對照設置：

陽性對照（自噬誘導劑如雷帕霉素、EBSS饑餓培養基）；

陰性對照（自噬抑制劑如氯喹）。

時間點優化：自噬是動態過程，需根據實驗設計選擇合適的時間點（如處理0、6、12、24小時）。

避免光漂白：熒光染料需避光操作，盡快觀察。

定量分析：

使用軟件統計熒光斑點數量或面積；

流式細胞儀定量CYTO-ID® 熒光強度。

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