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在 CAR-T 細胞療法等基因治療領域，慢病毒載體的整合位點檢測是保障臨床安全的關鍵環節。慢病毒載體在將治療性基因導入細胞時，可能隨機整合到宿主基因組中，存在插入突變風險，若整合到原癌基因附近，可能誘發細胞惡性轉化；若整合到抑癌基因內，可能導致其功能失活。因此，FDA、CDE 等監管機構明確要求對慢病毒整合位點進行精準檢測與風險評估。
慢病毒整合位點檢測方法
目前檢測慢病毒整合位點的主要平臺為高深度測序（NGS)。
Table 1. 主流的慢病毒整合位點檢測方法比較
標準化的整合位點標準品不僅能校準檢測方法的靈敏度與準確性，還能為不同實驗室的數據比對、方法驗證提供“通用標尺”。在進行方法學開發、性能驗證、試劑盒開發、日常檢測質控中都需要使用標準品。
NIBSC WHO標準品（18/144）
目前商業化常見的慢病毒整合位點標準品為NIBSC WHO 標準品（18/144），它由NIBSC制備并發起，聯合全球13個國家的31家實驗室檢測的結果，確定該標準品包含共計10個慢病毒已知整合位點，分布在10條不同的染色體上，該產品面世以來已被眾多國內外檢測機構用于慢病毒整合位點檢測項目的性能驗證及臨床檢測應用中的質控。盡管如此該產品在實際應用過程中仍存在一些短板和痛點,其中包括：
1
該產品選取公布的位點信息僅來自于31家實驗室大多數獲得的較為一致的結果，不排除有一些潛在的未被公布，對一些復雜的非典型的整合和插入方式（例如一端或部分LTR發生缺失的整合位點）可能存在漏報；
2
該產品的參數來自于多家檢測機構檢測結果的綜合和篩選，方法學上并未明確和統一，也并未就相應的位點進一步進行驗證性實驗；
3
該產品只公布了整合位點的染色體位置，而沒有明確插入位置兩端的確切拼接序列，沒有完整精確呈現各位點的插入情況；
4
該產品并未提供整合位點的位點頻率數據，只能作為定性參考品使用，不能直接用于準確性，精密度，檢測下限等相關性能驗證；
5
該產品經我們驗證是來自于一個單克隆的核酸樣本，而目前臨床上需要檢測整合位點的CAR-T樣本多為多克隆樣本。單克隆與多克隆樣本相比存在整合位點較為單一，位點頻率較高容易檢出等特點，因此對應臨床上大量多克隆樣品，整合位點繁多且低頻的特點，該產品并不能很好的模擬實際樣本的檢測。
科佰生物自主開發
針對上述痛點和缺陷，科佰生物自主開發了新一代的慢病毒整合位點標準品，該產品通過整合關聯擴增技術（IAA）以及常用的靶向捕獲技術和LAM-PCR三種方式結合NGS發現并驗證標準品的整合位點，保證了標準品中所有整合位點的準確完整報道，進一步結合了一代（Sanger）測序和數字PCR，精確定性和定量了所有整合位點的序列及頻率信息，做到了五重驗證。
另外為了進一步滿足CAR-T細胞整合位點的臨床檢測需求，模擬臨床的實際情況。我們采用了T細胞來源的細胞系制備該標準品，并且除了單克隆樣品，還制備了特定低頻（位點頻率低至2%）的多克隆樣本，且包含位點更多，覆蓋的染色體條數和區域更廣，可直接用于檢測方法的性能驗證，確定方法精密度，準確性，檢測限等指標，也更貼合臨床檢測中的實際情況。
兩種標準品的對比分析
科佰生物產品特點
1
高度模擬臨床樣本
T細胞來源系作為宿主，更貼近CAR-T治療的實際場景。通過單克隆+多克隆標準品的設置，模擬隨機整合和多克隆多位點低頻的復雜性。
2
多重技術驗證體系
五步正交驗證（NGS（整合關聯擴增技術（IAA，靶向捕獲， LAM-PCR）+ Sanger確認 + dPCR定量），確保位點序列與頻率的準確性。在驗證LTR整合基因組位點的基礎上，進一步驗證了載體上其他基因序列在基因組上的非典型整合位點。
3
靈活的頻率梯度設計
可提供 5%和2%低頻整合樣本，滿足FDA對插入突變風險評估的靈敏度需求。
4
標準化與可擴展性
單克隆樣本可作為“標準模塊”，按需混合生成多克隆標準品，適應不同檢測需求。
慢病毒整合位點標準品
針對這一要求，科佰生物推出多款慢病毒整合位點標準品。
| 貨號 | 名稱 |
CBPL0002 | Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard |
| CBPL0003 | Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard II (Single site) |
| CBPL0005 | 慢病毒整合位點分析參考試劑IV (含有性染色體插入) |
| CBPL0006 | 慢病毒整合位點分析陰性參考試劑 |
| CBPL0007 | 慢病毒多克隆多整合位點參考品-5% |
| CBPL0008 | 慢病毒多克隆多整合位點參考品-2% |
Fig1.CBPL0007 慢病毒多克隆多整合位點參考品-5%五步正交驗證結果
Fig 2. Results of CBPL0002 by NGS (Probe capture method).
Fig 3.Results of CBPL0002 by Sanger sequencing.
Fig 4.Results of CBPL0002 by ddPCR.
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