天然細胞中的蛋白質合成涉及化學環境、蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質機制之間復雜的相互作用，在制備某些特殊蛋白時會面臨諸多挑戰，比如膜蛋白的低表達量、毒性蛋白的細胞致死效應以及需要復雜翻譯后修飾蛋白的功能缺失等。這些"難表達蛋白"的制備瓶頸嚴重制約了相關基礎研究和臨床應用的發展。

無細胞蛋白表達技術（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）通過重構體外轉錄翻譯體系，在人工和無細胞環境中復制這種相互作用可以控制蛋白質合成的精度，為這類"頑固分子"的制備開辟了新路徑。

圖1:無細胞蛋白表達概述圖

無細胞蛋白表達技術通過提取細胞裂解物中的核心生物元件，構建開放式的體外合成系統。該技術突破傳統細胞表達的物理邊界：

1.細胞膜屏障的消解：通過物理破碎細胞釋放核糖體、轉錄因子等核心元件，消除細胞膜對大分子底物的通透性限制。

2.代謝網絡的解耦重構：將能量再生系統（如磷酸肌酸/肌酸激酶）、氨基酸供給、核苷酸循環等模塊獨立優化，實現代謝通量的精準調控。

1.膜蛋白：跨越脂雙層的表達革命

膜蛋白在細胞生物學和生物技術中發揮著至關重要的作用，從細胞信號傳導到治療發現。然而，膜蛋白 （MP） 很難在大腸桿菌等異源菌株中表達，必須使用修飾菌株，有時菌株會產生包涵體，這使得純化變得困難。鑒于膜蛋白合成的復雜性和對蛋白質-脂質-化學相互作用的有限理解，一種設計人工合成條件的方法至關重要。

無細胞體系通過創新策略實現膜蛋白表達的突破——納米盤（Nanodisc）技術：一種由磷脂雙層構成的微型圓盤結構，提供與天然細胞膜更接近的磷脂雙分子層環境，能夠高度模擬細胞膜的天然環境；有利于膜蛋白形成正確的天然構象，可以更好的維持膜蛋白構象穩定，有利于下游純化。

圖2:CFPS+Nanodisc表達情況

2. 毒性蛋白：突破細胞耐受的極限

毒性蛋白因具備破壞細胞結構、干擾代謝過程或直接殺傷宿主細胞的能力，在傳統表達純化系統中面臨多重技術瓶頸，比如BamHI限制性內切酶在傳統大腸桿菌系統中過表達時，其DNA切割活性會抑制宿主生長，表達量極低且難以獲得有活性的目的蛋白。

無細胞蛋白表達技術（CFPS）通過體外開放體系規避了傳統系統的局限性：

√無細胞毒性：裂解物已失去生命活性，毒性蛋白無法損傷宿主；

√開放式控制：可實時調整反應條件（如添加分子伴侶）優化蛋白折；

√簡化純化：反應液中雜質少，目標蛋白純度更高，且支持一步親和純化；

√高通量能力：支持多孔板或微流控芯片上的并行表達，加速毒性蛋白變體的篩選與優化。

應用實例：珀羅汀生物在自研無細胞體系中成功表達出BamHI限制性內切酶，如圖3A所示；并證明了PLD無細胞蛋白表達的BamHI限制性內切酶具有活性，如圖B所示（2,3,4,5泳道對應的質粒被切成線性模版，Z低濃度為 0.001 ug/uL即可顯示酶切活性）。

圖3:BamHI限制性內切酶在PLD無細胞系統中表達

3.  非天然氨基酸：重塑蛋白研究領域

天然氨基酸的種類數量存在一定局限，且其化學結構相對保守。基于天然氨基酸構建的天然蛋白質，在應對蛋白質工程以及蛋白藥物開發等領域的復雜研究需求時，難以提供全面且有效的支持。而非天然氨基酸（ nnAAs）擁有豐富多樣的側鏈基團結構。當把其引入蛋白質中時，能夠為蛋白質帶來全新的化學特性、空間結構以及特殊的功能表現，為生物研究、生物治療學以及合成生物學等學科領域提供了全新的探索方向和研究方法。

與細胞蛋白表達相比，無細胞蛋白表達系統在非天然氨基酸插入領域具有天然優勢：

√ 無細胞系統沒有細胞膜阻礙，規避了nnAAs選擇性問題；

√無細胞系統不受nnAAs可能產生的細胞毒性作用影響；

√有利于精細調控反應進程。

應用實例：珀羅汀生物對綠色熒光蛋白（GFP）進行非天然氨基酸定點插入，在CFPS體系中成功表達了含非天然氨基酸（pAcF/pAzF）的GFP，其中pAcF插入效率超過70%，如圖4所示。

圖4:PLD無細胞系統中非天然氨基酸插入

隨著AI技術的融入，無細胞體系正向智能化方向演進，未來，無細胞蛋白表達技術與人工智能的深度融合將引生物制造領域邁向全新高度，催生“智能、靈活、綠色”的蛋白生產新范式。一方面，AI將貫穿蛋白設計、反應優化到質量控制的全鏈條，通過海量數據訓練與實時反饋機制，實現生產流程的自動化與精準化，顯著縮短研發周期并降低成本；另一方面，無細胞系統的開放性與模塊化特性，將與AI驅動的分布式生產網絡結合，構建去中心化的“蛋白智造工廠”，使個性化醫療、現場應急合成等場景成為現實。

圖5:使用條件語言建模的人工蛋白質生成

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