帕金森病（PD）的神經(jīng)變性與外周免疫細(xì)胞（尤其是 T 細(xì)胞）浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）及其與腦內(nèi)細(xì)胞的相互作用密切相關(guān)，但 T 細(xì)胞與腦細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚未明確。

構(gòu)建一種由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的中腦類器官（hMO）與外周血 T 細(xì)胞組成的 3D 共培養(yǎng)模型，旨在模擬 T 細(xì)胞與中腦組織的空間相互作用，為研究 PD 相關(guān)免疫 - 神經(jīng)相互作用提供工具。

第一章：經(jīng)典回顧

（一）人中腦類器官（hMO）的生成與分化：hMO 由健康供體成纖維細(xì)胞重編程為 hiPSC 后誘導(dǎo)分化而來

• hiPSC 制備

• 健康供體成纖維細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) OCT3/4、c-MYC、SOX2、KLF4 四因子重編程為 hiPSC，篩選 TRA1-60 陽性率 > 95% 的細(xì)胞系。

• 分階段分化（30 天 / 60 天）

1. 神經(jīng)誘導(dǎo)階段（第 0-4 天）

2. hiPSC 單細(xì)胞接種于低吸附 U 型 96 孔板，使用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM/F12:Neurobasal=1:1，添加 N2、B27（無維生素 A）、GlutaMAX、非必需氨基酸、β- 巰基乙醇、肝素、10μM SB431542、200ng/ml Noggin、0.8μM CHIR99021），并加入 10μM ROCK 抑制劑 Y27632（前 48 小時(shí)），2 天更換一次培養(yǎng)基。

3. 中腦模式化階段（第 4-7 天）

4. 加入 100ng/ml SHH-C25II 和 100ng/ml FGF8，誘導(dǎo)神經(jīng)外胚層芽形成。

5. 組織生長(zhǎng)階段（第 7 天后）

6. 將類器官嵌入 20μL Matrigel，使用組織生長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含 Neurobasal、N2、B27、胰島素、層粘連蛋白、SHH-C25II、FGF8）培養(yǎng) 24 小時(shí)；隨后轉(zhuǎn)移至超低吸附 6 孔板，使用終分化培養(yǎng)基（含 BDNF、GDNF、抗壞血酸、db-cAMP），置于搖床上培養(yǎng)（促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)交換），每 2 天換液，持續(xù)至 30 天或 60 天。

（二）外周血 T 細(xì)胞的分離與激活

分離：健康供體外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中，通過 Pan T 細(xì)胞分離試劑盒（磁珠陰性選擇法）分離 T 細(xì)胞，培養(yǎng)于含 10% 熱滅活胎牛血清（FCS）的 RPMI 培養(yǎng)基中。

激活：使用 CD3/CD28 磁珠體外激活 T 細(xì)胞 48 小時(shí)（通過抗 CD3 和 CD28 抗體分別觸發(fā) T 細(xì)胞受體和共刺激分子），激活后渦旋 1 分鐘去除磁珠，用于后續(xù)共培養(yǎng)。

（三）共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟（核心部分）

1. 共培養(yǎng)條件優(yōu)化：通過測(cè)試 4 種培養(yǎng)基（hMOM、hMOM+IL-2、SFLM、SFLM+IL-2），評(píng)估 hMO 存活率和 T 細(xì)胞活性，確定最佳條件

• hMOM（中腦類器官培養(yǎng)基）

• 支持 hMO 存活的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含 Neurobasal、N2、B27、BDNF、GDNF 等）。

• IL-2 補(bǔ)充

• 25U/ml IL-2 可維持 T 細(xì)胞存活與激活（流式細(xì)胞術(shù)顯示 CD25 + 激活 T 細(xì)胞比例更高，存活率提升）。

• 最終選擇

• hMOM+IL-2 為共培養(yǎng)培養(yǎng)基（同時(shí)支持 hMO 存活和 T 細(xì)胞活性）。

2. 共培養(yǎng)操作流程

• 細(xì)胞準(zhǔn)備

• hMO：選擇 30 天齡（1 個(gè)月）或 60 天齡（2 個(gè)月）的 hMO（分別模擬不同成熟階段）。

• T 細(xì)胞：使用激活后的 T 細(xì)胞（CD3+CD25 + 比例約 100%）。

• 接種比例

• 每孔 2 個(gè) hMO 對(duì)應(yīng) 100 萬 T 細(xì)胞（參考 PD 患者死后中腦組織中 T 細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞比例）。

• 培養(yǎng)條件

• 24 孔板中加入 2ml hMOM+IL-2 培養(yǎng)基，放入 hMO 和 T 細(xì)胞。

• 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中，置于搖床上培養(yǎng) 7 天（促進(jìn)細(xì)胞接觸和營(yíng)養(yǎng)交換），每 2 天更換一次培養(yǎng)基。

3. 共培養(yǎng)后分析方法

• T 細(xì)胞浸潤(rùn)檢測(cè)

• 通過免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）染色 CD3 + 細(xì)胞，定量 hMO 中 T 細(xì)胞比例（流式細(xì)胞術(shù)或 ImageJ 計(jì)數(shù)）。

• 神經(jīng)細(xì)胞損傷評(píng)估

• TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡（定量 TUNEL + 細(xì)胞比例）。

• MAP2 免疫熒光染色（神經(jīng)元標(biāo)志物），通過平均熒光強(qiáng)度（MFI）評(píng)估神經(jīng)元丟失。

• T 細(xì)胞表型分析

• 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)浸潤(rùn) T 細(xì)胞的亞型（CD4+/CD8 + 比例）、細(xì)胞毒性分子（CD107a、顆粒酶 B）及細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-17、TNF-α 等）。

（四）本文研究的主要結(jié)果

1. T 細(xì)胞浸潤(rùn)與神經(jīng)損傷

2. 激活的 T 細(xì)胞可浸潤(rùn) hMO，且 60 天齡 hMO 浸潤(rùn)更多（年齡依賴性）；T 細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致 hMO 中 MAP2 + 神經(jīng)元減少，TUNEL + 凋亡細(xì)胞增加（與 T 細(xì)胞比例呈正相關(guān)）。

3. 腦區(qū)特異性

4. 與大腦皮質(zhì)類器官（hCO）相比，hMO 對(duì) T 細(xì)胞浸潤(rùn)更敏感，且 T 細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)損傷更顯著（符合 PD 中中腦易損性特征）。

5. 機(jī)制提示

6. 浸潤(rùn)的 T 細(xì)胞高表達(dá) LFA-1 和 VLA-4 整合素（與 hMO 中的 ICAM-1、VCAM-1 配體結(jié)合），且 CD8+ T 細(xì)胞分泌顆粒酶 B 等細(xì)胞毒性分子，CD4+ T 細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，共同介導(dǎo)神經(jīng)損傷。

上述3D 共培養(yǎng)模型可模擬 T 細(xì)胞與中腦組織的空間相互作用，揭示了 T 細(xì)胞浸潤(rùn)的年齡依賴性（老年 hMO 更敏感）和腦區(qū)特異性（中腦比皮質(zhì)更易受損），為研究 PD 中免疫介導(dǎo)的神經(jīng)變性機(jī)制及潛在治療靶點(diǎn)提供了新工具。

第二章：用于T細(xì)胞和中腦類器官共培養(yǎng)的其他研究方法

除了第一章節(jié)文中提到的 3D 直接共培養(yǎng)方法（hMO 與 T 細(xì)胞在 hMOM+IL-2 培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)），針對(duì) T 細(xì)胞與中腦類器官的共培養(yǎng)研究，還有多種方法可從系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞互作模式、環(huán)境模擬等角度優(yōu)化或擴(kuò)展

從微環(huán)境模擬（如Kirkstall Quasi Vivo微流控類器官串聯(lián)芯片、支架）、細(xì)胞互作模式（間接共培養(yǎng)、多細(xì)胞協(xié)同）、病理相關(guān)性（疾病特異性模型）和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)（實(shí)時(shí)成像）等角度擴(kuò)展了共培養(yǎng)體系，可根據(jù)研究目標(biāo)（如機(jī)制探索、藥物篩選）選擇適配的方法。例如，微流控模型適合研究 T 細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，Kirkstall Quasi Vivo多細(xì)胞串聯(lián)共培養(yǎng)模型更適合解析免疫網(wǎng)絡(luò)對(duì)神經(jīng)變性的調(diào)控。

一、微流控芯片共培養(yǎng)系統(tǒng)

原理與設(shè)計(jì)

利用微流控技術(shù)構(gòu)建仿生微環(huán)境，通過微通道分隔或連接類器官與 T 細(xì)胞區(qū)域，精準(zhǔn)控制細(xì)胞接觸方式、營(yíng)養(yǎng)梯度和可溶性因子交換，模擬體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)和組織微環(huán)境。

操作要點(diǎn)

• 芯片結(jié)構(gòu)

• 設(shè)計(jì)雙腔室或多通道芯片，一側(cè)接種中腦類器官（hMO），另一側(cè)接種 T 細(xì)胞，通過微米級(jí)通道連接（通道孔徑可調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞遷移能力）。

• 流體控制

• 采用 syringe pump 維持培養(yǎng)基低速流動(dòng)（如 1-5 μL/min），模擬腦內(nèi)組織液循環(huán)，確保營(yíng)養(yǎng)和代謝物交換，同時(shí)避免剪切力損傷細(xì)胞。

• 優(yōu)勢(shì)

• 可實(shí)時(shí)觀察 T 細(xì)胞定向遷移（通過通道進(jìn)入 hMO 區(qū)域）的動(dòng)態(tài)過程；精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞因子（如趨化因子 CXCL12）的濃度梯度，研究其對(duì) T 細(xì)胞浸潤(rùn)的影響；避免傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)中代謝物積累的問題，延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間（可至 2-4 周）。

二、間接共培養(yǎng)模型（非接觸式）

原理

通過物理屏障（如 Transwell 小室）分離 hMO 與 T 細(xì)胞，僅允許可溶性因子（細(xì)胞因子、趨化因子等）通過，研究 T 細(xì)胞通過 “旁分泌作用” 而非直接接觸對(duì)中腦組織的影響。

操作要點(diǎn)

• Transwell 設(shè)置

• 將 hMO 接種于下室（6 孔板），T 細(xì)胞接種于上室（0.4 μm 孔徑的 Transwell 插入式小室，允許小分子通過但阻止細(xì)胞遷移）。

• 培養(yǎng)基

• 使用文中優(yōu)化的 hMOM+IL-2 培養(yǎng)基，確保上下室營(yíng)養(yǎng)一致。

• 檢測(cè)指標(biāo)

• 下室 hMO 的神經(jīng)元存活（MAP2 表達(dá)）和凋亡（TUNEL）；上室 T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如 IFN-γ、TNF-α）水平（通過 ELISA 或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)）；對(duì)比直接共培養(yǎng)結(jié)果，區(qū)分 “T 細(xì)胞直接接觸損傷” 與 “細(xì)胞因子介導(dǎo)的間接損傷”。

三、多細(xì)胞共培養(yǎng)模型（引入腦內(nèi)常駐細(xì)胞）

1. 加入小膠質(zhì)細(xì)胞（腦內(nèi)常駐免疫細(xì)胞）

原理

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的核心細(xì)胞，可與 T 細(xì)胞相互作用（如呈遞抗原、分泌細(xì)胞因子），共同影響神經(jīng)元存活。該模型更接近體內(nèi) “T 細(xì)胞 - 小膠質(zhì)細(xì)胞 - 神經(jīng)元” 的復(fù)雜互作網(wǎng)絡(luò)。

操作要點(diǎn)

• 小膠質(zhì)細(xì)胞來源

• 從 hiPSC 誘導(dǎo)分化為小膠質(zhì)細(xì)胞（通過添加 CSF1、IL-34 等因子），或使用原代小膠質(zhì)細(xì)胞。

• 共培養(yǎng)步驟

1. 先將小膠質(zhì)細(xì)胞與 hMO 共培養(yǎng) 3 天（讓其整合入類器官）；

2. 再加入激活的 T 細(xì)胞，使用 hMOM+IL-2 培養(yǎng)基，置于搖床上培養(yǎng) 7 天。

• 優(yōu)勢(shì)

• 研究小膠質(zhì)細(xì)胞是否通過 “吞噬 T 細(xì)胞釋放的顆粒酶” 或 “分泌抗炎因子（如 IL-10）” 調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷，解釋免疫細(xì)胞間的協(xié)同或拮抗作用。

2. 引入血管內(nèi)皮細(xì)胞（模擬血腦屏障）

原理

血腦屏障（BBB）破壞是 T 細(xì)胞浸潤(rùn)腦內(nèi)的前提，通過在 hMO 表面構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞層（模擬 BBB），研究 T 細(xì)胞如何突破屏障進(jìn)入中腦組織。

操作要點(diǎn)

• BBB 模擬

• 在 hMO 表面接種人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC），培養(yǎng) 5-7 天形成緊密連接（通過檢測(cè) ZO-1、Claudin-5 等緊密連接蛋白驗(yàn)證）。

• 共培養(yǎng)

• 將 T 細(xì)胞接種于內(nèi)皮細(xì)胞層外側(cè)，觀察其是否通過 “破壞緊密連接” 或 “跨內(nèi)皮遷移” 進(jìn)入 hMO，通過電鏡或免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮屏障完整性（如 permeability 實(shí)驗(yàn)）。

四、3D 支架輔助共培養(yǎng)

原理

使用生物相容性支架（如明膠、海藻酸鈉水凝膠）為 hMO 和 T 細(xì)胞提供更接近體內(nèi)的三維空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用，增強(qiáng)類器官的成熟度和 T 細(xì)胞的浸潤(rùn)效率。

操作要點(diǎn)

• 支架制備

• 將 hMO 嵌入含 ECM 成分（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白）的水凝膠中，支架孔隙率控制在 100-200 μm（允許 T 細(xì)胞遷移）。

• 共培養(yǎng)

• 在支架周圍接種 T 細(xì)胞，使用 hMOM+IL-2 培養(yǎng)基，通過 confocal 顯微鏡觀察 T 細(xì)胞在支架內(nèi)的遷移路徑及與 hMO 的空間接觸。

• 優(yōu)勢(shì)

• 支架可調(diào)節(jié)硬度（模擬腦內(nèi)不同區(qū)域的機(jī)械特性），研究力學(xué)信號(hào)對(duì) T 細(xì)胞 - 神經(jīng)元互作的影響（如中腦區(qū)域的軟硬度是否促進(jìn) T 細(xì)胞浸潤(rùn)）。

五、疾病特異性共培養(yǎng)模型

原理

文中使用健康供體的 hMO 和 T 細(xì)胞，而疾病特異性模型可通過引入 PD 患者來源的細(xì)胞，更精準(zhǔn)模擬病理狀態(tài)下的免疫 - 神經(jīng)互作。

操作要點(diǎn)

• PD 患者 hMO

• 從 PD 患者皮膚成纖維細(xì)胞重編程為 hiPSC，誘導(dǎo)分化為 hMO（攜帶 PD 相關(guān)突變，如 LRRK2 G2019S），其多巴胺能神經(jīng)元通常表現(xiàn)出 α- 突觸核蛋白聚集、線粒體功能異常等表型。

• PD 患者 T 細(xì)胞

• 分離 PD 患者外周血 T 細(xì)胞（可能存在異常激活表型，如 Th17 細(xì)胞比例升高）。

• 共培養(yǎng)

• 采用文中優(yōu)化的 hMOM+IL-2 條件，對(duì)比患者與健康對(duì)照的 T 細(xì)胞浸潤(rùn)能力、神經(jīng)損傷程度，揭示 PD 特異性免疫機(jī)制。

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