一、產品信息

平臺編號：Bio-73560

規格：1×10?Cells/T25培養瓶

細胞信息：原代細胞

細胞名稱：人椎間盤髓核細胞

培養條件：原代細胞取組織現分

組織來源：椎間盤組織

用途：研究

注意事項：僅用于科學研究或者工業應用等非醫療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產品信息以出庫為準）

二、細胞簡介

人椎間盤髓核細胞分離椎間盤組織；椎間盤是位于脊柱兩椎體之間，分為部的髓核，富于彈性的膠狀物質；周圍部的纖維環，由多層纖維軟骨環按同心圓排列。上下有軟骨板，是透明軟骨復蓋于椎體上，下面骺環中間的骨面。上下的軟骨板與纖維環一起將髓核密封起來。纖維環由膠原纖維束的纖維軟骨構成，位于髓核的四周。纖維環的纖維束相互斜行交叉重疊，使纖維環成為堅實的組織，能承受較大的彎曲和扭轉負荷。髓核，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，為椎間盤結構的一部分，位于兩軟骨板與纖維環之間。由縱橫交錯的纖維網狀結構即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質構成的彈性膠凍物質。嬰幼兒時期的髓核含水量為80%-90%，即使到了老年，其含水量也在70%上下。髓核在出生時體積大而松散，位于椎間盤的，至成年時位置移至椎間盤的中后部；在成年以前構成髓核的主要物質是大量蛋白多糖復合體、膠原纖維和纖維軟骨，隨著年齡的增長，髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分逐漸減少，膠原增粗并逐漸被纖維軟骨所替代。

三、方法簡介

實驗室分離的人椎間盤髓核細胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法并結合軟骨細胞專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

四、質量檢測

實驗室分離的人椎間盤髓核細胞經Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

五、培養信息

培養基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每3-4天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 梭形、多角形

傳代特性 可傳5代左右；3代以內狀態

消化液 0.25%胰蛋白酶

培養條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

人椎間盤髓核細胞體外培養周期有限；建議使用配套的專用生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的培養狀態。

六、主要應用

人椎間盤髓核細胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法并結合軟骨細胞專用培養基培養篩選制備而來。人椎間盤髓核細胞主要用于科學研究。

七、操作步驟

1、將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2、用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3、0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4、3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5、封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6、細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7、二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8、將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9、復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10、封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11、鏡檢觀察。

八、細胞處理方法

以下細胞處理方法及細胞說明書僅供參考,產品僅用于科研具體操作還需要根據到貨時細胞密度,細胞生長狀態等具體情況,酌情處理,如需要更詳細技術指導,請及時電話或郵件聯系。

（一）貼壁細胞

1、客戶接收到細胞,用75%的酒精消毒(建議配制75%酒精的水是滅菌過的)培養瓶外部。

2、肉眼觀察細胞培養基顏色,顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數拍照(建議收到時的培養瓶拍一張照片,顯微鏡拍收到時的細胞100X ,200X 各一張)。

3、顯微鏡觀察細胞,當細胞融匯至80%左右(可以傳代的情況下),細胞應該在37度培養箱預溫1-2h后再做處理。如未達到細胞傳代密度,培養瓶應預留一部分培養基繼續培養。

4、嚴格無菌操作,打開細胞培養瓶。

5、將細胞培養瓶內的培養基用吸管吸出(嚴禁直接傾倒),放入另一無菌容器中(建議換新的培養基培養細胞)。

6、用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面,加入適量的0.05%胰酶-EDTA消化細胞,顯微鏡下觀察細胞變圓,輕輕拍打培養瓶直到細胞脫落,加入終止液終止。

7、1000rpm,5min離心,重懸細胞。換新的細胞培養瓶,37℃,5%CO2  培養。

（二）懸浮細胞

1、接收到細胞,用75%的酒精消毒(建議配制75%酒精的水是滅菌過的)培養瓶外部。

2、肉眼觀察細胞培養基顏色,顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數拍照(建議收到時的培養瓶拍一張照片,顯微鏡拍收到時的細胞100X ,200X 各一張)。

3、嚴格無菌操作,打開細胞培養瓶。

4、將細胞培養瓶內的培養基用吸管吸出(嚴禁直接傾倒)。

5、1000rpm,5min離心,重懸細胞。換新的細胞培養瓶,37℃,5%CO2 培養。

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