細胞復蘇操作

• 準備培養基和耗材 ：提前準備好適合永生化人表皮角質形成細胞生長的培養基，如含有 5-10v/v% 胎牛血清、10-100IU/ml 青霉素、10-100μg/ml 鏈霉素的高糖 DMEM 培養基等，同時準備好 PriCoat™ECM T25 培養瓶或 Applied Cell 細胞外基質涂層的培養瓶。

• 取出凍存細胞 ：從液氮罐或 - 130°C 以下的保存環境中取出凍存的永生化人表皮角質形成細胞，迅速放入 37°C 水浴中快速解凍，輕輕搖晃使其均勻受熱，直到凍存管內的干冰全溶解。

• 細胞處理與培養 ：將解凍后的細胞懸液轉移至離心管中，加入適量的培養基輕輕吹打混勻，然后進行離心，去除凍存液。再用新鮮培養基重懸細胞，將其接種到預先準備好的培養瓶中，輕輕搖晃使細胞均勻分布，放入 37.0°C、5% CO? 的培養箱中進行培養。

細胞傳代操作

• 觀察細胞狀態 ：在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態和密度，當細胞生長至培養瓶壁的 80%-90% 時，即可進行傳代操作。

• 細胞消化與收集 ：棄去培養瓶中的舊培養基，加入適量的 PBS 清洗細胞，去除殘留的培養基和雜質。加入胰蛋白酶消化液，在 37°C 下孵育 1-2 分鐘，觀察細胞是否從瓶壁脫落。當細胞大部分脫落后，加入含血清的培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其分散成單個細胞或小細胞團，然后將細胞懸液轉移至離心管中，進行離心收集細胞。

• 細胞計數與接種 ：對離心后的細胞進行計數，根據需要的傳代比例，將細胞懸液按適當的比例接種到新的培養瓶中，加入新鮮的培養基，輕輕搖晃培養瓶使細胞均勻分布，放入培養箱中繼續培養。

細胞凍存操作

• 準備凍存液和凍存管 ：凍存液一般由基礎培養基、胎牛血清和 DMSO 按一定比例配制而成，如含 90% 胎牛血清和 10% DMSO 的凍存液。準備好標記好細胞名稱、凍存日期等信息的凍存管。

• 細胞收集與處理 ：將培養好的永生化人表皮角質形成細胞用胰蛋白酶消化并收集，離心去除培養基和消化液，用凍存液重懸細胞，調整細胞密度至適當濃度，一般為 1×10^6 cells/ml 左右。

• 細胞分裝與凍存 ：將細胞懸液分裝到凍存管中，每管 1-2ml。將凍存管放入 - 80°C 冰箱中預凍 2-4 小時，然后轉移到液氮罐中長期保存。在凍存過程中，要盡量保持溫度的均勻下降，以減少細胞內冰晶的形成對細胞的損傷。