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高效液相色譜儀的主要操作要點 你了解多少？
高效液相色譜儀（HPLC）作為物質(zhì)分離與定量分析的精密儀器，其操作規(guī)范性直接決定分析結(jié)果的準確性與重復(fù)性。從樣品預(yù)處理到數(shù)據(jù)輸出的全流程中，每一個操作細節(jié)都可能影響最終結(jié)果，尤其在制藥、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等對精度有要求的領(lǐng)域，嚴格遵循操作要點是保障數(shù)據(jù)可靠性的關(guān)鍵。以下從前期準備、系統(tǒng)操作、異常處理等維度，詳解 HPLC 的核心操作規(guī)范。
開機前的準備與系統(tǒng)檢查
開機前的準備工作是避免儀器損傷和數(shù)據(jù)偏差的基礎(chǔ)。首先需檢查流動相的兼容性與純度：反相色譜常用甲醇、乙腈等有機溶劑，需確保試劑級別為色譜純（純度≥99.9%），避免使用分析純試劑中的雜質(zhì)污染色譜柱；水相需采用超純水（電阻率≥18.2MΩ?cm），并通過 0.22μm 濾膜過濾，防止顆粒物堵塞色譜柱或單向閥。混合流動相需提前計算配比（如乙腈 - 水 = 60:40，體積比），混合后需超聲脫氣 20 分鐘（脫氣不充分會導(dǎo)致泵壓波動，影響基線穩(wěn)定性），脫氣后的流動相應(yīng)在 48 小時內(nèi)使用，避免再次溶解空氣。
色譜柱的檢查與安裝需格外謹慎。使用前需確認色譜柱型號與分析需求匹配（如 C18 柱適用于非極性化合物，氨基柱適用于糖類分析），查看柱效是否在合格范圍（通過標準品測試，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于出廠值的 80%）。安裝時需注意流向標識，柱接頭與儀器接口對齊后輕輕擰緊（避免過度用力導(dǎo)致螺紋損壞），連接完成后用 5-10 倍柱體積的流動相沖洗色譜柱（流速 1.0mL/min），排除柱內(nèi)保存液（如甲醇），使色譜柱達到平衡狀態(tài)。
儀器各部件的狀態(tài)檢查不可忽視。泵的密封圈需每月檢查是否老化（若出現(xiàn)漏液需及時更換），進樣器的定量環(huán)需確認體積是否與方法匹配（常用 10μL、20μL、50μL），檢測器的流通池需清潔無氣泡（可通過反向沖洗排除氣泡）。對于二極管陣列檢測器（DAD），開機前需預(yù)熱氘燈 30 分鐘，確保光源穩(wěn)定（燈能量應(yīng)≥800μAU）。
樣品處理與進樣操作規(guī)范
樣品處理的質(zhì)量直接影響分析結(jié)果的準確性，需遵循 “代表性、純凈性、適用性” 原則。液體樣品需通過 0.22μm 濾膜（有機相樣品用尼龍膜，水相樣品用混合纖維素膜）過濾，去除顆粒物；固體樣品需用合適溶劑溶解（如中藥材用甲醇超聲提?。崛∫航?jīng)離心（3000r/min，10 分鐘）后取上清液過濾。樣品溶液的濃度需與檢測器靈敏度匹配（如紫外檢測器的樣品濃度通常在 0.1-10μg/mL），濃度過高會導(dǎo)致色譜峰過載（峰形拖尾或前沿），需稀釋至線性范圍內(nèi)。
自動進樣器的操作需注意細節(jié)控制。樣品瓶需使用螺紋口瓶（避免進樣針穿刺時漏液），樣品體積不低于瓶體積的 1/3（防止進樣針吸空），瓶蓋墊需選用與溶劑兼容的材質(zhì)（如聚四氟乙烯墊耐有機溶劑）。進樣前需用樣品溶液沖洗進樣針 3-5 次（沖洗體積為定量環(huán)體積的 3 倍以上），避免殘留樣品污染。手動進樣時，需遵循 “進樣 - 切換閥 - 保持 - 復(fù)位” 的步驟：將進樣針插入樣品溶液，緩慢抽取過量樣品（約為定量環(huán)體積的 2 倍），排出氣泡后將針插入進樣口，推動活塞至定量環(huán)充滿，切換閥至 “進樣” 位置，保持 1-2 秒后復(fù)位，整個過程需避免引入氣泡（氣泡會導(dǎo)致峰面積偏?。?/span>
進樣量的設(shè)置需根據(jù)方法要求精準控制。對于痕量分析（如農(nóng)藥殘留檢測），可適當增大進樣量（如 50μL）以提高靈敏度；而復(fù)雜基質(zhì)樣品（如血液、土壤提取液）需減少進樣量（如 5μL），避免污染色譜柱。進樣后需記錄樣品編號與進樣順序，確保數(shù)據(jù)與樣品對應(yīng)，尤其在批量分析時需建立樣品登記表格，防止混淆。
色譜參數(shù)設(shè)置與系統(tǒng)優(yōu)化
色譜參數(shù)的合理設(shè)置是實現(xiàn)高效分離的核心。流速需根據(jù)色譜柱規(guī)格調(diào)整：4.6mm 內(nèi)徑的色譜柱常用流速 1.0mL/min，2.1mm 內(nèi)徑的細徑柱常用 0.3-0.5mL/min（流速過高會導(dǎo)致柱壓超過儀器上限，通常不超過 40MPa）。柱溫箱溫度需穩(wěn)定（波動≤±0.1℃），反相色譜常用 30-40℃（升高溫度可改善峰形，縮短保留時間），而手性分離等特殊分析需精確控制溫度（如 25℃±0.5℃）。
檢測器參數(shù)需與目標物特性匹配。紫外檢測器需選擇最大吸收波長，帶寬設(shè)置 2-4nm（提高信噪比）；熒光檢測器需優(yōu)化激發(fā)波長與發(fā)射波長（如黃曲霉毒素 B1 的激發(fā)波長 365nm，發(fā)射波長 435nm）；
數(shù)據(jù)記錄與系統(tǒng)維護
數(shù)據(jù)記錄與處理需符合溯源性要求。每次分析需記錄儀器型號、色譜柱信息、流動相配比、流速、柱溫、檢測波長等參數(shù)，保留原始數(shù)據(jù)文件（包括色譜圖、峰面積、保留時間），不可隨意刪除或修改。定量分析時需采用標準曲線法：配制 5-7 個濃度的標準溶液，按濃度遞增順序進樣，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)（R2）需≥0.9990，否則需重新配制標準溶液。
分析結(jié)束后的系統(tǒng)維護是延長儀器壽命的關(guān)鍵。需用純?nèi)軇_洗色譜柱：反相柱先用 10% 甲醇水溶液沖洗 30 分鐘（去除水溶性雜質(zhì)），再用甲醇沖洗 30 分鐘（保存色譜柱）；正相柱需用正己烷沖洗，避免柱內(nèi)殘留極性溶劑。泵的維護需在關(guān)機前用純甲醇或乙腈沖洗 10 分鐘，防止鹽溶液結(jié)晶堵塞單向閥（若流動相含緩沖鹽，需先用水沖洗 30 分鐘，再用有機溶劑沖洗）。
檢測器的維護需針對性進行：紫外檢測器需關(guān)閉氘燈（延長使用壽命），流通池若污染可用 10% 硝酸沖洗；RID 檢測器需確保參比池與樣品池的溶劑一致，關(guān)機前需沖洗干凈；DAD 檢測器需記錄氘燈使用時間（累計使用超過 2000 小時需更換）。儀器使用完畢后需填寫操作記錄，包括使用時間、樣品數(shù)量、儀器狀態(tài)、異常情況等，為后續(xù)維護提供依據(jù)。
常見異常情況處理
分析過程中需及時應(yīng)對常見異常，確保數(shù)據(jù)可靠性。若出現(xiàn)基線漂移（漂移量超過 0.5mAU/h），可能是流動相比例不穩(wěn)定或柱溫波動，需檢查泵的混合精度、柱溫箱溫度；若基線噪音過大，需排查檢測器是否污染、流動相是否有雜質(zhì)，可更換新流動相或清洗流通池。
色譜峰異常的處理需針對性分析：峰拖尾可能是色譜柱污染（需沖洗或更換色譜柱）、流動相 pH 不當（調(diào)整 pH 至目標物 pKa±2 范圍）；峰分裂可能是進樣量過大（減少進樣量）、樣品溶劑與流動相不兼容（調(diào)整樣品溶劑）；保留時間漂移可能是流動相比例變化（檢查泵的單向閥）、柱溫變化（校準柱溫箱）。
系統(tǒng)壓力異常需立即停機檢查：壓力過高可能是管路堵塞（依次斷開各部件排查堵塞點）、色譜柱污染（反沖色譜柱）；壓力過低可能是漏液（檢查各接頭是否擰緊）、泵故障（更換密封圈）。處理壓力異常時需緩慢降低流速，避免壓力驟變損壞色譜柱。
高效液相色譜儀的操作是一門 “精細活”，需要操作人員兼具理論知識與實踐經(jīng)驗，從樣品處理到數(shù)據(jù)輸出的每一步都需嚴謹把控。規(guī)范的操作不僅能保障分析結(jié)果的準確性與重復(fù)性，更能延長儀器使用壽命，降低維護成本。在制藥、食品等嚴格監(jiān)管領(lǐng)域，操作記錄的完整性與規(guī)范性更是符合 GMP、ISO 等認證要求的關(guān)鍵，因此，建立標準化操作流程（SOP）并嚴格執(zhí)行，是高效液相色譜分析工作的核心保障。
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