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酶免疫測定的酶—大分子蛋白結(jié)合物的制備
酶結(jié)合物可以說是酶免疫測定試劑盒的核心組成部分。通常酶免疫測定試劑盒的有效使用期限即是根據(jù)酶結(jié)合物的穩(wěn)定性而定的。因為在酶免疫測定試劑盒中，zui易受外環(huán)境影響的組成試劑即是酶結(jié)合物。此外，酶結(jié)合物的質(zhì)量亦是影響試劑盒質(zhì)量的很重要的因素之一，可見酶結(jié)合物的制備對于酶免疫測定來說，是非常關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。
酶—抗體（或其他大分子蛋白）結(jié)合物是酶免疫測定的有機組成部分，也是其測定基礎(chǔ)之所在。通常，酶結(jié)合物（酶標抗體或抗原）一般均是通過化學交聯(lián)而得到的。一個理想的化學交聯(lián)方法應(yīng)能得到分子組成明確、酶及抗體或抗原不失活、連接鍵穩(wěn)定且經(jīng)濟的*耦合的結(jié)合物。
酶—蛋白的耦合方法可分為三大類，即①酶與蛋白的隨機共價交聯(lián)方法；如戊二醛方法；②通過特定化學基團進行共價交聯(lián)的方法，如過碘酸鈉方法及采用各種均一和非均一雙功能交聯(lián)劑的方法；③通過非共價鍵交聯(lián)的方法，如酶—抗酶免疫復(fù)合物方法。這些方法各有其優(yōu)缺點，如戊二醛方法，由于交聯(lián)的隨機性，所得到的酶結(jié)合物大小不一，其中許多分子量很大，超過1 000kD，這樣的酶結(jié)合物的酶活性與游離酶相比，將大大降低。此外，大分子的酶結(jié)合物在免疫測定還有可能對測定形成空間位阻。使用過碘酸鈉方法制備酶結(jié)合物，操作簡單，所得到的酶結(jié)合物大小合適，酶的活性可以保留80％以上。酶—抗酶免疫復(fù)合物這種非共價鍵交聯(lián)方法并非嚴格意義上的酶—蛋白耦聯(lián)方法，本處不做介紹。
下面介紹幾個具體的酶與蛋白大分子的交聯(lián)方法。
1、過碘酸鈉方法
Nakame和Kawaoi于1974年設(shè)計了這種可用于糖蛋白且極為有效的化學耦聯(lián)方法，以后又有人對這種方法進行了改良，這種改良方法是目前用于HRP標記抗體或抗原的zui常用的方法。與GA方法比較，這種方法的得到的耦聯(lián)物的產(chǎn)率至少要高3～4倍。方法的原理如下：過氧化物酶的所有氨基首先用1—氟—2，4—二硝基苯（Sanger試劑）（DNFB）不可逆地封閉，然后用Nal04氧化過氧化物酶的糖鏈（占總重量的21％），產(chǎn)生醛基和羧基，醛基與所加入的蛋白（1gG或SPA）的游離氨基形成Schiff堿（但不與本身已封閉的氨基作用），這種不穩(wěn)定的氨基—羰基化合物可用硼氫化鈉（NaBH：）還原形成穩(wěn)定的耦聯(lián)產(chǎn)物（圖6—1）。這種方法大約會使70％的過氧化物酶和約99％的IgG耦聯(lián)。每個IgG分子zui多可耦聯(lián)5—6個過氧化物酶分子。如要得到每個IgG分子結(jié)合酶分子的一定比，可在理論上計算出應(yīng)加入到抗體中的活化的過氧化物酶的量。
2、使用化學交聯(lián)試劑耦聯(lián)酶與抗體或其他蛋白
用于酶與抗體或其他蛋白耦聯(lián)的所有化學交聯(lián)試劑至少要有兩個反應(yīng)基團，根據(jù)其兩個反應(yīng)基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)試劑。均一的雙功能交聯(lián)劑，其兩個反應(yīng)基團相同；而在非均一的雙功能交聯(lián)劑中，兩個反應(yīng)基團不同，每個基團可能于不同的條件下反應(yīng)。理論上，非均一交聯(lián)劑的基團的結(jié)合反應(yīng)易于控制。一般來說，均一的雙功能試劑只能用于一步法，即將酶和其他蛋白（例如抗體、抗原、SPA或親合素）與交聯(lián)劑一起混合后反應(yīng)。一步法難于控制結(jié)合物的大小和組成。如果第二個基團的活化要求不同的條件或待交聯(lián)蛋白之一與該交聯(lián)劑反應(yīng)不強時，某些均一的雙功能交聯(lián)劑亦可用于兩步方法。
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