大鼠

MEM FBS 胰酶 EDTA D-Hanks’液

眼科剪 滴管 離心機 培養皿 CO2培養箱

1. SD 大鼠經低溫麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預冷的D-Hanks’液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。

2. 剪碎組織成1 mm³ 大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱內消化20 min，中間搖晃一次。

3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的 MEM＋10%FBS(Glial Medium，GM)的離心管內終止消化液作用5 min。

4. 吸出組織轉移到另一支裝有冷的 GM 的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內。重復上述步驟 2～3 次。

5. 所得上清于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內加入新鮮培養液并吹打成單細胞懸液。細胞計數，調整細胞密度1.5×10⁵/cm² 種入 25 cm² 培養瓶，放入孵箱培養。以后每隔2～3 d 進行全量換液。

6. 搖床振搖分離星形膠質細胞和少突膠質細胞：培養至7～10 天，換液后放入孵箱繼續培養24 h，取出擰緊培養瓶蓋，于37℃恒溫搖床上280 rpm 搖 動18 h。此時寡突膠質細胞 90%以上在培養懸液內而與瓶底貼壁的星形膠質細胞分離。

7. 分離培養懸液內的少突膠質細胞：吸出懸液至離心管內950  rpm 離心10  min，棄上清后管內加入新鮮GM，吹打成單細胞懸液，按1.5×10⁵/cm² 種入預先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的 35 mm 培養皿培養。24 h 后換成DF12＋N2 的無血清 培養液，此后每三天半量換液1 次。

8. 瓶底星形膠質細胞的繼續培養：25 cm² 培養瓶內的星形膠質細胞用D-Hanks’液洗2 次后常規傳代，以 1.5×10⁵/cm² 種入預先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的35 mm 培養皿培養。培養液為GM，每三天半量換液1 次。附GFAP鑒定星形膠質細胞圖片。

圖1：星形膠質細胞(GFAP 鑒定)

大鼠

CMF-Hanks液 胰蛋白酶 DMEM F12

水浴鍋 培養箱

一、原代培養

1.  選用生后1周的新生大白鼠，用碘酒,酒精棉球消毒，斷頭取其大腦皮層組織。
 

2.  解剖顯微鏡下，剝離腦膜，切除大腦髓質部分。
 

3.  將大腦皮質在無Ca²⁺、Mg²⁺Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。
 

4.  室溫下靜置10 min。
 

5.  在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30 min。
 

6.  加入少許含20%血清的DMEM/F12(DMEM與F12為1:1)混合培養液(下同)，用吸管稍加吹打至胰酶液與培養液混勻。離心5 min(1 000 r/min)。
 

7.  吸去上清含酶液，重新加入含血清培養液，用吸管反復吹打至組織塊消散為止。制成細胞懸液(暫稱初細胞懸液)。
 

8.  將初細胞懸液接種到玻璃瓶(或培養皿)中，于37℃、5%CO₂培養箱中孵育30 min。
 

9.  翻轉培養瓶,吸出瓶中的細胞懸液。用孔徑為75μm的不銹鋼網過濾。
 

10.  將濾過液離心10 min(1 000 r/min)，濃縮成約3ml的細胞懸液(暫稱為次細胞懸液)。
 

11.  將次細胞懸液種植到預先涂布有多聚賴氨酸的培養瓶中。接種的細胞密度約1×10⁴個/cm²。
 

12.  置CO₂培養箱中培養3-5h,再補加足夠的培養液,繼續培養9-14 h。培養液顏色略微變黃時換液。

二、原代培養物的傳代
 

1.  吸取舊培養液用CMF-Hanks液洗滌2次。
 

2.加入少許0.125%的胰蛋白液消化15 min。以有血清培養液終止胰酶活性。
 

3.稍事手動搖晃,倒掉含酶液。加入有血清培養液。
 

4.用吸管反復吹打使細胞從培養瓶壁脫落。收集細胞懸液,離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液，給細胞沉淀物再加入培養液制成細胞懸液。
 

5.重復原代培養時8-10步。
 

6.將細胞懸液按0.5×10⁵個/cm²的密度種植在經鼠尾膠原包被的培養瓶中。
 

7.送入CO₂培養箱中培養3-5 h，再加足夠的培養液,繼續培養。

三、結果

分離的大鼠大腦皮質細胞在原代培養4 h后，部分細胞即可長出細小胞突。培養3-4 d之后，細胞數量便明顯增大。大鼠大腦皮質細胞原代培養一般在9-14 d，以星形膠質細胞為主的細胞即可長滿培養瓶壁。