Biocoat 血管生成系統(tǒng)：內(nèi)皮細(xì)胞侵襲

BD 產(chǎn)品貨號：354141、354145、354146

儲存和運(yùn)輸：-20度儲存，干冰運(yùn)輸。

操作指南：

血管生成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞活化后表達(dá)基質(zhì)蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat 內(nèi)皮細(xì)胞侵襲系統(tǒng)提供了抗/促血管再生化合物的體外定量實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?nèi)皮細(xì)胞侵襲系統(tǒng)包括：BD Falcon24多孔培養(yǎng)小室，含配套接收板和蓋子；BD fluoroBlok熒光屏蔽3.0μm孔徑PET膜，預(yù)包被Matrigel基質(zhì)，具體操作步驟如下：

1 凍融

1.1 從-20℃冰箱中取出包裝，使其自然升溫到室溫。

1.2 在小室內(nèi)加入0.5ml37℃預(yù)熱的基本培養(yǎng)基，在37℃CO₂環(huán)境下凍融15-45分鐘，待用。

1.3 凍融后，小心去去除培養(yǎng)基，避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。可用抽吸或倒置培養(yǎng)板并輕拍的方法去除培養(yǎng)基。

2 侵襲實(shí)驗(yàn)：用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標(biāo)記

細(xì)胞侵襲基質(zhì)膜穿過熒光標(biāo)記膜后，采用熒光標(biāo)記定量。

2.1 采用如1.1的步驟凍融，對照板無需凍融。

2.2 胰酶酶解細(xì)胞單層，使其懸浮在無血清培養(yǎng)基中，濃度為2.0×10⁵/mL。*的接種細(xì)胞濃度需要采用一系列細(xì)胞濃度進(jìn)行優(yōu)化，包括在下室培養(yǎng)表面的濃度（例如，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板）。例如，接種濃度為10⁵cell/cm²時(shí)，采用濃度為0.5×10⁵到5.0×10⁵ cell/cm²的范圍確定*的接種濃度。

2.3 在上小室中加入0.25mL的細(xì)胞懸浮液（5.0×10⁴ cell/well）。

2.4 通過進(jìn)樣口，快速加入750μl含5%FBS或適量生長因子（比如BDVEGF）的培養(yǎng)基，作為底部小室的化學(xué)誘導(dǎo)劑。

2.5 小室和對照小室在37℃，5%CO₂環(huán)境下培養(yǎng)22±1小時(shí)。

3、細(xì)胞侵襲能力的測定：用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標(biāo)記定量

注意：對于每一個完成得培養(yǎng)板，需要12.5mL的HBSS和50μg的鈣黃綠素。HBSS的使用時(shí)為了減少熒光染色劑自動水解引起的高背景熒光。

3.1 準(zhǔn)備濃度為4μg/mLd 高黃綠素。12.5mL的HBSS37℃預(yù)熱。50μg高黃綠素用20μLDMSO溶解，加入150μL預(yù)熱的HBSS。將其轉(zhuǎn)入大量的HBSS中，用150μL預(yù)熱的HBSS清洗熒光染料的容器。

3.2 孵育后，小心去除上小室中的培養(yǎng)基。注意小心轉(zhuǎn)移鄰近小室底部的培養(yǎng)基。可以通知抓住培養(yǎng)板，輕輕拍打，使培養(yǎng)基從下部滴落。避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。

3.3 將培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移到另一塊24孔板中，該孔板含有0.5mL每孔的4μg/mL鈣黃綠素。在37℃，5%CO₂環(huán)境下孵育90分鐘。

3.4 侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機(jī)底部讀數(shù)取得，激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長517nm。只有侵襲并通過Matrigel FluoroBlok^TM膜后細(xì)胞才能被檢測。

注意：后標(biāo)記所使用的染色劑不局限于胞核染色，比如SYTO-24，在血清培養(yǎng)基環(huán)境中具有較低背景，不需要使用第二塊板用于標(biāo)記。

4、侵襲研究：DilC12（3）熒光染色劑預(yù)標(biāo)記法

細(xì)胞接種于孔板之前先用于染色劑標(biāo)記，可用于均一化實(shí)驗(yàn)，所得到的實(shí)時(shí)動力曲線可揭示細(xì)胞通過基底膜侵襲的能力，不需要分解和破壞各個時(shí)間點(diǎn)。

4.1 如1.1所示凍融。

4.2 不同濃度的各類熒光素對細(xì)胞標(biāo)記的程度不同，標(biāo)記濃度和時(shí)間，接種細(xì)胞濃度和化學(xué)誘導(dǎo)劑必須先優(yōu)化。

4.3 胰酶消化細(xì)胞單層，制備細(xì)胞懸液，溶于無血清DMEM培養(yǎng)基，濃度為2×10⁵cell/mL。*的接種細(xì)胞濃度需要采用一系列細(xì)胞濃度進(jìn)行優(yōu)化，包括在下室培養(yǎng)表面的濃度（例如，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板）。例如，接種濃度為10⁵cell/cm²時(shí)，采用濃度為0.5×10⁵到5×10⁵ cell/cm²的范圍確定*的接種濃度。

4.4 在上小室中加入0.25mL的細(xì)胞懸液（5.0×10⁴cell/小室）。

4.5 通過進(jìn)樣口，快速加入750μL含有5%FBS或適量生長因子（如BD VEGF）的培養(yǎng)基，作為下室的誘導(dǎo)劑。

4.6 小室和對照小室在37℃，5%CO₂環(huán)境下培養(yǎng)22±1小時(shí)。

5、細(xì)胞侵襲的計(jì)算：用DilC12（3）熒光染色劑后標(biāo)記定量

侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機(jī)底部讀數(shù)取得，激發(fā)波長549nm，發(fā)射波長565nm。只有侵襲通過Matrigel FluoroBlok膜被標(biāo)記的細(xì)胞才能被檢測。

6、結(jié)果計(jì)算

注意：數(shù)據(jù)可以用相對熒光值RFU或侵襲百分比表示，后者在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理中更有用。

背景扣除：計(jì)算平均背景值，將其從各個孔板中扣除。

6.1 侵襲百分比

侵襲百分比%=通過基質(zhì)膜包被的熒光膜侵襲細(xì)胞的平均相對熒光值/通過未包被熒光膜侵襲的平均相對熒光值×100

6.2 信噪比

信噪比S/N=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲的相對熒光值/對照組細(xì)胞侵襲的相對熒光值

自動化操作注意事項(xiàng)

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yǎng)小室系統(tǒng)能適用于自動化操作系統(tǒng)。蓋子可以用標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械手取走，也可用吸力取走。

2 為了避免各孔間污染，孔板設(shè)定為一個統(tǒng)一的方向。為了與培養(yǎng)小室匹配，確保Falcon的商標(biāo)均在2者上方，面向同一個方向。

3 任何規(guī)格的槍頭都能達(dá)到小室的兩邊。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。