一、實驗前應明確的問題

1.  選擇適當的細胞接種濃度。

一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.  藥物濃度的設定。

一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。

3.  時間點的設定。

在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的zui明顯）。

4.  培養時間。

200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說，很難維持68 h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48 h換液的。

5.  MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞數。

做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

6.  理論未必都是對的。

要根據自己的實際情況調整。

7.  實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。

調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.  避免血清干擾。

用含15%胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

二、實驗步驟

（一）貼壁細胞

1.  收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.  5%CO₂，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度，每孔100 ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。

3.  5%CO₂，37 ℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5.  終止培養，小心吸去孔內培養液。

6.  每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

7.  同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。

（二）懸浮細胞

1.  收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40 ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養液稀釋 （儲存液100 ug/ml，需預試尋找*稀釋度，1：10-1：20）；③需檢測物10 ul；④細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100 ul 1640）。

2.  置37 ℃，5%CO₂孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值）

4.  離心（1000轉x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光值。

5.  同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。