一、材料與設(shè)備

(一) 實驗動物

出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。

(二) 實驗試劑

低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精。

培養(yǎng)液：培養(yǎng)液(DMEM，新生牛血清，青鏈霉素)。

(三) 器械與儀器

鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織)、100 ml 廣口瓶兩個(分別裝碘酒和酒精棉球)、500 ml 燒杯、250 ml 錐形瓶、15 ml和 50 ml 的離心管，磁力攪拌器和攪拌子(或者水浴振蕩器)、150-200 目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。

二、實驗流程

(一) 實驗步驟

1. 將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。

2. 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開 皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。 然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復(fù)以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。注：為了保證心肌細胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺上或 者預(yù)冷的平衡鹽液中。

3. 用第二套手術(shù)器械進行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預(yù)先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中(或者其它合適容器中，視個人習(xí)慣)，加少許 0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補加胰酶至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一個消毒的500 ml燒杯，裝好無菌的蒸餾水，加夠水量，水位線稍低于250 ml錐形瓶的刻度線即可，過少則溫度會不均勻，過高容易污染。打開磁力攪拌器電源，預(yù)先將水溫調(diào)節(jié)到 37℃)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 rpm左右，消化15 min(務(wù)必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時間不超過 15 min)。或者，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉(zhuǎn)速和消化時間相同。

4. 從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。

5. 加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機械分散細胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過分吹打，否則會導(dǎo)致組織過度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數(shù)目少(比如 5、6 只的時候)，消化時間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預(yù)冷的含 10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，*次消化收集的分離出的細胞，*次消化結(jié)束后；繼續(xù)第二次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。

6. 重復(fù)第5步消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數(shù)的組織塊(不含棄去消化液的那次)。

7. 第 1、2 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網(wǎng)后，一起離心；第 3、4 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網(wǎng)后，一起離心。zui后，分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細胞，接種到一個 75 cm²的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時后，取出，棄貼壁細胞(主要是成纖維細胞和內(nèi)皮細胞)，將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5-6×10⁵個/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。

8. 一般不用加BrdU，如果培養(yǎng)時間長(發(fā)現(xiàn)成纖維細胞也極少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU，心肌細胞搏動的持續(xù)時間會更長。

9. 接種后 24 小時，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細胞一次，以去處未貼壁的細胞(部分細胞會在 24 小時后貼，結(jié)果很多細胞重疊生長)，再更換培養(yǎng)液，即可。可以按照實驗需要在培養(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。

(二) 實驗結(jié)果

心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁，此時細胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好，DMEM培養(yǎng) 基在初始培養(yǎng)時為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充。鑒定的zui 簡單的辦法就是搏動與否，注意：當(dāng)搏動比較微弱的時候，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動，換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外，心肌細胞表達肌動蛋白，可以作為鑒定，但不是*的特 征性指標，因為平滑肌細胞也表達。

三、經(jīng)驗總結(jié)

(一) 新生大鼠鼠齡的選擇

新生大鼠心肌細胞在出生后3 d內(nèi)具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌細胞則為終末分化細胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生時間越短，其心肌細胞分離后成活率越高，越容易貼壁生長。大量觀測表明，選擇1~3 d齡大鼠分離其心肌細胞進行原代培養(yǎng)較為理想。其中尤以半日齡大鼠心肌細胞培養(yǎng)效果*。　

(二) 消化酶的選擇及使用

新生大鼠心肌細胞的分離可采用組織塊法和消化法，前者因不易獲得密度均一的細胞且難控制成纖維細胞的生長而較少采用。消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白 酶、膠原酶I或II以及透明質(zhì)酸酶。透明質(zhì)酸酶多與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用。胰蛋白酶作用較強，容易造成心肌細胞損壞。膠原酶作用較緩和，能消化細胞間 質(zhì)中的膠原纖維以釋放細胞，對細胞損傷小，且在新生大鼠心肌組織，以膠原I為主,故我們選用膠原酶I。文獻報道膠原酶的工作濃度一般在0.6~1 g?L^-1，我們使用的為0.8 g?L^-1。膠原酶現(xiàn)用現(xiàn)配。

(三) 消化程度的把握

新生大鼠心肌細胞對酶消化極為敏感。消化過度可使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動能力；消化不足，細胞聚集成團，無法分清細胞邊界，難以形態(tài)學(xué)觀測。消化過程中使用磁力攪拌器時應(yīng)注意1)轉(zhuǎn)速一般控制在60~80 r?min^-1左右。(2)每次消化的時間須結(jié)合消化酶濃度確定。(3)將粘附在攪拌子上的心肌組織吹散，使酶液充分接觸組織。(4)適宜溫度為35~37℃。(5)當(dāng)組織由紅轉(zhuǎn)白呈半透明狀態(tài)時，應(yīng)停止消化。

(四) 接種的細胞密度

　心肌細胞接種密度不僅影響細胞間的相互接觸，進而影響細胞對肥大刺激的反應(yīng)，而且影響長期培養(yǎng)細胞的成活率。接種細胞的數(shù)量應(yīng)經(jīng)計算。一般而言，應(yīng)根據(jù)實驗的觀測目的決定單位面積上的細胞數(shù)量。例如，如作形態(tài)學(xué)觀測,六孔板中每孔的接種細胞數(shù)量應(yīng)控制在1×10⁵~2×10⁵個；若需收獲心肌細胞作mRNA或蛋白表達水平的觀測，則每孔的接種密度可增加到5×10⁵~6×10⁵個。

(五) 細胞的分散度與接種的均勻性

分離出的心肌細胞，在溶液中Ca²⁺作用下較容易出現(xiàn)集聚現(xiàn)象。因此，在進行 差速貼壁前后，均應(yīng)反復(fù)多次地輕柔吹打使心肌細胞成單個分散狀態(tài)。接種后，應(yīng)小心使心肌細胞均勻地分布于培養(yǎng)板上,避免細胞向培養(yǎng)孔的中央集聚。此外，可 將培養(yǎng)板放入孵箱后用滴管輕輕吹打各孔中央部位2~3次，但應(yīng)格外注意避免污染。

(六) 對成纖維細胞的抑制與血清種類的選擇

成纖維細胞較心肌細胞更容易貼壁且具有分裂增殖能力，經(jīng)差速貼壁后仍有少量成纖維細胞混雜于心肌細胞之中，若處理不當(dāng)，很容易生長成優(yōu)勢細胞。溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干擾細胞的有絲分裂，故常規(guī)使用BrdU抑制成纖維細胞的生長。但是，如果使用胎牛血清培養(yǎng)細胞，由于胎牛血清所含的促細胞有絲分裂的因子較多，BrdU很難*抑制成纖維細胞的生長。改用小牛血清則可克服這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，獲得高達90％以上的心肌細胞。

(七) 換液時間

進行心肌細胞形態(tài)學(xué)觀測時，接種密度較低，貼壁的心肌細胞數(shù)量減少，為避免成活心肌細胞隨換液而被丟棄，應(yīng)在接種48 h后換液。這樣不僅使貼壁的心肌細胞數(shù)量明顯增加，而且BrdU作用時間較長，對成纖維細胞的抑制作用更確實。此外，去血清后可用ITS和0.1 g?L^-1BSA對心肌細胞進行營養(yǎng)支持，對心肌細胞貼壁率與凋亡率均不產(chǎn)生明顯影響。

(八) 抗污染措施

除應(yīng)注意無菌操作等常規(guī)技術(shù)方法外，還應(yīng)特別注意以下幾點：(1)獲取心臟時避免剪破消化道。比較穩(wěn)妥的辦法是在劍突上一肋處入剪，這樣做不涉及腹腔，也 就減少了污染機會。(2)如條件允許，應(yīng)避免乳鼠心肌細胞與其他細胞在同一孵箱內(nèi)共同培養(yǎng)，以防止發(fā)生交叉污染。(3)對于培養(yǎng)心肌細胞的觀察、照相每次 時間不可過長，否則既會導(dǎo)致培養(yǎng)液pH改變，又能增加污染機率。

(九) 培養(yǎng)液pH值

提醒：適宜的pH范圍在7.2~7.4之間，配制及使用培養(yǎng)液時應(yīng)注意：

1. pH值會在過濾后上升0.1~0.3。

2. 培養(yǎng)液中加入血清后pH值會有降低，降低程度與血清品質(zhì)和含量有關(guān)。

3. 應(yīng)及時換液。

4. 配制好的培養(yǎng)液不宜長時間貯存在4℃。這是因為培養(yǎng)液中的CO₂會溢出，使培養(yǎng)液pH上升。每次配好的培養(yǎng)液盡量在2 wk內(nèi)用完，否則應(yīng)部分置于－20℃保存，使用前應(yīng)補充谷氨酰胺和NaHCO₃，再次過濾后方可使用。