糖化酶活力測定（直接滴定法）

原理

采用可溶性淀粉為底物，在一定的pH值與溫度下，使之水解為葡萄糖 (還原糖)，以直接滴定法測定。

試劑及儀器

（1） 堿性酒石酸銅鉀溶液（使用時等體積混合甲、乙溶液）： 甲液：稱取15.693g硫酸銅(Cu₂SO₄·5H₂O)，0.05g次甲基藍，用水溶解并稀釋定容至1000mL； 乙液：稱取50g酒石酸鈉鉀，54g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋定容至1000mL

（2） 0.1%標準葡萄糖溶液：準確稱取1g無水葡萄糖（預先在100-1050C烘干），用水溶解，加5mL濃鹽酸，用水定容至1000mL。

（3） pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：

0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀釋至1000mL；

0.2mol/L 乙酸鈉溶液：稱取27.2g乙酸鈉（CH₃COONa·3H₂O），用水定容至1000mL；

pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸鈉溶液等體積混合。

（4） 0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g氫氧化鈉，用水溶解并定容至1000mL。

（5） 2%可溶性淀粉溶液：準確稱取2g可溶性淀粉（預先于10-105 0C烘干），加少量水調勻，傾入80mL沸水中，繼續煮沸至透明，冷卻后用水定容至100mL。

（6） 固體曲

（7） 滴定管、電子天平、燒杯、恒溫水浴鍋、脫脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶

測定步驟

（1） 5%固體曲浸出液制備：稱取5.0g固體曲（以絕干曲計），置于250mL燒杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，攪勻，于30℃水浴中保溫浸1小時，每隔15min攪拌一次。用脫脂棉過濾，濾液為5％固體曲浸出液。

（2）固體曲糖化液的制備：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴預熱10min。準確加入5mL 5％固體曲浸出液，搖勻，立即記下時間。于30℃水浴準確保溫糖化1小時。迅速加入15mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，終止酶解反應。冷卻至室溫，用水定容至刻度。

同時作一空白液：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，然后準確加入5mL 5％固體曲浸出液，用水定容至刻度。

（3）定糖

空白液測定：吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各5mL，置于150mL三角瓶中，準確加入5mL空白液，并用滴定管預先加入適量的0.1%標準葡萄糖溶液，使滴定時消耗的0.1%標準葡萄糖溶液在1mL以內，搖勻。于電爐上加熱至沸騰，立即用0.1%標準葡萄糖溶液滴定至藍色消失，此滴定操作需在1min內完成。

糖化液測定：準確吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。

實驗現象和數據記錄

表1 定糖消耗的標準葡萄糖體積

（其中在做定糖的糖化液預實驗時發現用標準葡萄糖溶液滴定糖化液時，沒有滴加標準葡萄糖溶液時，糖化液在煮沸時由藍色變為無色，所以我們小組把糖化液稀釋了10倍后再做糖化液的定糖實驗）

計算與結果

固體曲糖化酶活力定義：1g絕干固體曲，在30℃、pH4.6、1小時內水解可溶性淀粉為葡萄糖的毫克數。

 分析與討論

  該實驗結果存在著誤差，誤差的原因：①我們小組的空白液和糖化液都只是做一次實驗，而沒有做平行實驗，改進方法是各做3次平行實驗；②因為我們的空白液滴定是用原液，而糖化液是用10倍稀釋的，所以也會是結果不那么，改進放法：應把空白液也作10被稀釋比較好。