關鍵詞:基因甲基化檢測|實驗技術服務
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基因甲基化檢測|實驗技術服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
DNA甲基化是zui早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。
檢測程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化;反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，zui后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導致熔解溫度的變化.
送樣要求
細胞(≥106 個)、組織(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等樣品材料，基因組DNA(體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位點與程度的實驗方法有三類：
（1）（M SREs）利用對甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點，從而產(chǎn)生片段差異，電泳后，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點與甲基化程度，
（2）另一類是利用將沒有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì)，而甲基化的C不會發(fā)生相應變化來識別甲基化位點。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
（3）一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應，促使熒光素發(fā)光并進行檢測，Pyrosequencing技術是近年一種全新的技術，這項技術曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來自于序列分析的原始數(shù)據(jù)，通過峰值的高度可以的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復性和性。