遷移實驗（cell migration assay）

 實驗材料
（1）ThinCert插入式細胞培養器: 24-well, 8.0-μm pore membranes （Greiner662638）

（2）細胞培養相關試劑：無血清培養基，10％血清培養基，PBS，0.02％EDTA

（3）固定液：甲醇

（4）染色液：Giemsa染液

（5）封片劑：中性樹膠

（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片

 操作步驟

（1）所有細胞培養試劑和ThinCert放在37℃溫育；

（2）待測細胞培養至對數生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養基先后洗滌一次，

 用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度  為2×105 /ml；

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養基，上 室加入100－

 150μl細胞懸液，繼續在孵箱培養24小時；

（4）用鑷子小心取出ThinCert，吸干上室液體，移到預先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；

（5）取出ThinCert，吸干上室固定液，移到預先加入約800μl Giemsa染液 的孔中，室溫染色15－30分鐘；

（6）輕輕用清水沖洗浸泡數次，取出ThinCert，吸去上室液體，用濕棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的細胞；

（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；

 （8）顯微鏡下取9個隨機視野計數，統計結果。

  注意事項

（1）根據待測細胞體積大小選擇合適孔徑的ThinCert。常用的為8.0-μm孔徑（如

  AGS細胞），如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；

（2）根據待測細胞的遷移能力強弱調整細胞數和遷移時間。常規24-well  ThinCert接種細胞數約

 為2≈5×104/well， 遷移時 間 12≈36小時；

（3）由于Greiner公司的24-Transwell內含24個獨立的ThinCert，為了避免操作污染，

 每次實驗可預先另準備一塊24孔普通培養板（Greiner）；

（4）如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無血清培養24小時獲得 的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），

 具體可查  閱相關文獻；

（5）細胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；

（6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細胞，

 以免影響讀數。尤其是  膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；

（7）Chamber和膜上都無法標記，操作時應小心避免混淆實驗組和對照組；

（8）充分晾干，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。