腫瘤的早期診斷對于患者的治療具有重要的意義，而大多數方法在特異性、可操作性及經濟性方面均較滿足世衛組織的要求，如針對腫瘤代謝產物、蛋白質生物標記物或循環腫瘤細胞的檢測。

外泌體是由細胞內多泡小體與細胞質膜融合后釋放進入細胞外環境的磷脂雙分子層包封囊泡，直徑約40-100nm，其在血清和體液中的豐度較高，且含有腫瘤源性核酸、蛋白質和其它生物標記物，可能在腫瘤發生和轉移過程中扮演著重要的角色，在腫瘤的預測及早期診斷上具有較大的臨床應用潛力。



但現有的外泌體分離技術，如離心、超速離心、磁珠分離以及基于親和捕獲的微流方法，非常耗時，且純度、處理量、重復性較差，還有可能導致外泌體表面修飾，不利于后續功能分析。

而使用簡單的三步連續過濾方法，包括直流預過濾、切向流過濾和低壓蝕刻膜過濾，可從細胞培養上清或體液中分離外泌體，保證較高的純度、確定的粒徑分布以及功能性完整，并有效去除游離的蛋白質和其它低分子量物質、大于100nm的細胞外囊泡以及細胞碎片。

三步連續過濾操作包括：

? 0.1μm 直流過濾

以MDA乳腺癌細胞培養獲得的150ml上清液先用0.1μm直流濾器過濾去除漂浮細胞、細胞碎片以及較大的剛性培養基成分，外泌體和較大的柔性顆粒通過膜。
 

? 500kD 切向流過濾
 

將收集的濾液轉移至錐形瓶中，并在4℃條件下進行切向流過濾，使用KrosFlo 研發用 IIi 切向流過系統，結合500kD MidiKros mPES中空纖維過濾組件。包括游離蛋白在內的小分子通過中空纖維膜孔進入濾液，而包括外泌體和小囊泡在內的大分子，被截留在循環液中，并濃縮至50ml。

然后再以PBS進行5體積的恒體積洗濾，以進一步去除小分子污染物。洗濾結束后，將回流樣品濃縮至~10ml，并以10ml PBS沖洗系統，回收管路及過濾器內可能殘留的外泌體，提高收率。

過濾過程中，通過壓力監測和背壓閥調節，將跨膜壓控制在1.5-2.5psi的較低水平，以避免較小的外泌體被“擠”入濾液。

? 100nm 蝕刻膜過濾
 

收獲的回流液再用100nm蝕刻膜過濾器過濾。過濾時將跨膜壓控制在3.5psi以下，以避免柔性的非外泌體小囊泡通過進入濾液。

對于連續過濾法獲得的外泌體樣品，使用動態光散射、納米示蹤、免疫金標記透射電鏡、總蛋白、斑點雜交以及LC-MS/MS蛋白組學等方法進行檢測分析，并超速離心獲得樣品比較。

結果顯示，連續過濾可獲得高純度的外泌體，且由于分離過程中的外力較低，外泌體可保持功能性完整。而整個過程可開發成*自動化的系統，節省操作時間，降低人工操作可能導致的變異，并降低過濾過程的壓力波動。這種分離方式的大規模樣品處理能力，使其可作為新型、*非侵入的腫瘤篩選方法。

此外，切向流過濾也可用于去除含血清培養基中的外泌體，由于某些外泌體具有免疫特性，可能會增強調節T細胞功能、抑制自然殺傷細胞或者誘導T細胞凋亡，影響整體細胞培養產品的性能。zui近已有“無外泌體FBS”產品發布。而使用500kD 的中空纖維切向流過濾技術可有效去除細胞培養基中的外泌體