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ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題和解決方法

來(lái)源:北京博蕾德科技發(fā)展有限公司   2015年09月23日 14:20  

ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題和解決方法


ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測(cè)的方法,主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡(jiǎn)單,整個(gè)測(cè)定過(guò)程中卻有諸多影響因素,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題,我們將常見(jiàn)問(wèn)題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表:


問(wèn)題一:高背景或陰性對(duì)照值偏高

可能原因

建議

陰性對(duì)照孔被陽(yáng)性對(duì)照或樣品污染

洗滌時(shí),勿將洗液溢出孔外。

洗滌不充分

確保在洗滌時(shí)每個(gè)孔都充滿了液體,確保將殘余液體從孔中移除。

酶結(jié)合物過(guò)濃

請(qǐng)檢查酶結(jié)合物是否按說(shuō)明書(shū)規(guī)定稀釋

孵育溫度過(guò)高

檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定

底物在使用前曝光

應(yīng)保存在暗處,避光。

讀板前停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)


問(wèn)題二:陽(yáng)性對(duì)照值偏低或低吸光度

可能原因

建議

蒸發(fā)

各步之間,須使用封版膠密封反應(yīng)板。

溫度不均勻

校準(zhǔn)孵育箱,勿疊放反應(yīng)板。


問(wèn)題三:邊緣效應(yīng)

可能原因

建議

蒸發(fā) 

各步之間,須使用封版膠密封反應(yīng)板

溫度不均勻 

校準(zhǔn)孵育箱,勿疊放反應(yīng)板


問(wèn)題四:標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳 

可能原因

建議

倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未混勻 

稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻

過(guò)早稀釋

標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時(shí)稀釋

加入的體積不正確

使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器,快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個(gè)微孔中


問(wèn)題五:標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好,但樣本無(wú)檢測(cè)信號(hào)

可能原因

建議

樣本中無(wú)檢測(cè)物或檢測(cè)物含量極低

設(shè)置內(nèi)參,重新實(shí)驗(yàn)

樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測(cè)

作適當(dāng)稀釋,降低其他物質(zhì)的干擾,或作系列稀釋,檢測(cè)回收率。

樣本中檢測(cè)物濃度過(guò)高,Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值

適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本,檢測(cè)物濃度盡量在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)。


問(wèn)題六:重復(fù)性較差

可能原因

建議

微孔中有氣泡

用針尖挑破氣泡

試劑未混勻

確保充分混勻試劑

樣本中有雜質(zhì)或沉淀物

使用前離心

微孔包被面被吸頭劃破

加液時(shí)小心操作

使用用過(guò)的封板膠紙

每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔

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