細胞一般在凍存及復蘇的時候，很多客戶因為操作不當，比如溫度、保護劑、時間等沒控制好，導致凍存及復蘇細胞的時候，細胞容易出現活性差、狀態不好等情況，其實細胞凍存及復蘇的基本原則是“慢凍快融”，這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性；緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結晶在很短的時間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

這次淺談一下細胞凍存的具體操作步驟及要點：

細胞凍存操作要點：

1、細胞凍存前12~24h，換新鮮培養基，使細胞一直處于對數生長期。

2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。

3、棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為3×10⁶~1×10⁷cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據各實驗室實際條件調整）

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一個晚上→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內可直接放入-80℃放一個晚上，再轉至液氮罐內。注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于zui低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

5、細胞凍存后應取出一管復蘇，技術細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存。