人胚胎干細胞（hES）培養

MEF細胞鋪制：

1. 在T25培養瓶中加入5% Matrigel，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細胞培養箱中至少放置30 min以上。
2. 吸除Matrigel，加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養液。一般地，一個T25培養瓶中加入5 ml MEF*培養液。
3. 按實驗需要復蘇MEF若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含2 ml MEF*培養液的15 ml離心管內，以    1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養液1 ml，重懸后按照一個T25培養瓶鋪1′106的MEF細胞，平均加入到T25 培養瓶，輕輕搖勻后置于37℃細胞培養箱。48h以后可以傳入人胚胎干細胞。
5. 復蘇或傳代hES細胞前，將T25培養瓶中的MEF*培養液吸除，加入2 ml hES*培養液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的hES*培養液待用。

復蘇：

1. 將hES細胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含3-4 ml hES*培養液的15 ml離心管內，以1000 rpm，離心5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的hES*培養液2-3 ml，吹打一次使細胞懸浮。
4. 轉移至1個已經鋪好MEF細胞的T25培養瓶中培養。
5. 復蘇第二天不換液，第三天起每天更換hES細胞*培養液。

注意：復蘇后48小時換液，期間不要挪動細胞。hES復蘇后大約4-5天才開始有克隆出現。

傳代：

1. 一般在復蘇后第7-10天傳代，正常傳代為7天一次。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入4-5 ml的1 mg / ml的Collagenase-type IV至培養瓶，輕輕晃動，使之覆蓋底面，置于37℃培養箱內消化細胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至克隆邊緣大部分脫落（一般需要30-60 min）。
6. 用10 ml移液管輕輕吹打，將克隆吹下，細胞懸液轉移至15 ml離心管中，放置一會，待克隆自然沉降后將上層Collagenase-type IV吸除，加入hES*培養液3 ml，放置一會，待克隆自然沉降后將上層培養液吸除。
7. 加入的hES*培養液3 ml，用10 ml移液管吹打2-3次，細胞自然沉降，將上層吹打的過小的克隆及培養液吸除，加入hES*培養液3 ml，懸浮細胞，按照1:4的比例進行傳代。
8. 放入37℃培養箱內培養。
9. 第二天不換液，第三天起每天換液，換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。

注意：復蘇后48小時換液，期間不要挪動細胞。hES復蘇后大概4-5天才開始有克隆出現。

凍存：

1. 按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。
2. 細胞自然沉降，吸除上層培養液，逐滴加入已經預冷的凍存液，輕輕懸浮細胞。
3. 按每支凍存管內加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過一夜，轉入液氮。

凍存液配方： 
hES*培養液60%，ES級FBS 30%，DMSO 10%