小鼠胚胎干細胞（mES細胞）、小鼠iPS細胞培養

MEF細胞鋪制：

1. 在T25培養瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細胞培養箱至少放置15 min以上。
2. 吸除0.2%明膠，加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養液。一般地，一個T25培養瓶中加入5 ml MEF*培養液。
3. 按實驗需要：小鼠胚胎干細胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF，復蘇MEF細胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含2 ml MEF*培養液的15 ml離心管內，以    1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養液1 ml，重懸后按照一個T25培養瓶鋪1′106的MEF細胞，平均加入到T25培養瓶中，輕輕搖勻后置于37℃細胞培養箱。24 h以后可以傳入小鼠胚胎干細胞或小鼠iPS細胞。
5. 復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞或小鼠iPS細胞前，將T25培養瓶中的MEF*培養液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液待用。

復蘇：

1. 將小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含3-4 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液的15 ml離心管內，以1000 rpm，離心5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液2 ml，吹打懸浮。
4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉移至1個已經鋪好MEF細胞的T25培養瓶中培養。
6. 每天更換小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液。

傳代：

1. 一般在復蘇后第2-3天傳代，視克隆大小和密度而定。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養箱內消化細胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
6. 加2 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液終止消化。
7. 多次輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液。
8. 加入足量的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好MEF細胞的T25培養瓶中。一般地，一個T25培養瓶加入5-6 ml培養液。
9. 放入37℃培養箱內培養。
10. 每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存： 

1. 按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。
2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經預冷的凍存液，懸浮細胞。
3. 按每支存管內加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過一夜，轉入液氮。

凍存液配方： 
小鼠胚胎干細胞*培養液或小鼠iPS*培養液60%，ES級FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細胞與MEF細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）： 

1. 培養中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞*培養液重懸細胞，吹打混勻，細胞懸液分裝到無MEF細胞的培養皿或培養瓶（一般地，一個T25培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞，在一個10 cm培養皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與MEF細胞）中。
2. 培養皿或培養瓶置于37°C培養箱內靜置1小時。
3. 1小時后，絕大部分MEF細胞已貼在培養皿或培養瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中。
4. 收取培養液，進行后續實驗。