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酶切反應注意事項

來源:青島捷世康生物科技有限公司   2016年01月15日 11:20  

酶切反應注意事項

限制酶價格昂貴,操作時應注意下列原則

  1. 許多購得限制酶為濃縮液,通常1ul(約10單位)酶液足以在1小時內切割10ugDNA。當需要從觀眾取出少量酶液時,可用一次性移液器吸頭稍稍接觸頁面,這樣可取出少至0.1ul的酶液。另一種方法是將一根孔徑很小的塑料管(Icm長)套在1ul的微量注射器上,然后吸取酶液。濃縮的酶液可在使用前1X反應緩沖液稀釋,但絕不能用水稀釋,以免變性失活。
  2. 限制酶在含50%甘油的緩沖液中,-20℃下可穩定保存。在家酶反應之前,反應管中應預先加入除了酶以外的所有其他試劑。從冰箱中取出酶后,立即放于冰上。每次取酶都必須使用無菌的新吸頭,如果酶被DNA或其他酶污染,則費錢耗時,影響工作。不鞥呢讓酶在冰箱外放置過久,更不能讓其溫度大于0℃,應盡快操作,用完后立即將酶放回冰箱。
  3. 酶應分裝成小份盡量避免反復凍融。
  4. 反應中盡肯能少加水,使反應體積保持zui小,但必須保證酶液的體積不超過總反應體積的10%,否則酶液中的甘油會抑制酶的活性。
  5. 通常延長反應時間可以減少酶的用量,當切割大量DNA時,這樣做比較節約。
  6. 當需在許多管DNA樣品中用同一種酶時,應計算所需酶的總量(包括略微增加一點酶量以彌補轉移過程中的損失),然后取出酶,用適當的1X酶反應緩沖液稀釋,再將酶稀釋液分別加至各個反應管中。如果DNA需要用兩種或更多種酶切割,而某一種緩沖液對兩種酶都很適合,則反映可同時進行。如果需要不同的緩沖液,則有兩種辦法①采用下表中的三種緩沖液,先用適合低離子濃度緩沖液的酶切割DNA,然后加入適量的NaCI調節緩沖液中的鹽濃度并加入第二種酶。②使用表二中的適合于所有限制酶KGB(谷氨酸鉀緩沖液)通過緩沖液

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