豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法－

酶聯免疫吸附測定(ELISA)法

豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法－

酶聯免疫吸附測定(ELISA)法
 

范圍

本標準規定了豬肉中己烯雌酚殘留量檢測的制樣和酶聯免疫吸附測定法。

本標準適用于豬肉中己烯雌酚的殘留量的快速篩選檢測。對于可疑樣品需用確證法確認。

規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標準。

GB/T 1.1-2000 標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規則 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)

GB/T 6682-1992  分析實驗室用水規則和試驗方法

農牧發[2003]1號  獸藥殘留試驗技術規范（試行）

制樣

樣品的制備

取適量新鮮或冷凍的空白或供試豬肉組織，絞碎并之使均勻，密封。

樣品的保存

-20℃以下冰箱中貯存備用。

測定方法

方法提要或原理

豬肉中殘留的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取，酶聯免疫吸附測定法測定,其基本原理是抗原抗體反應。酶標板的微孔包被有偶聯抗原，標樣或樣品中的己烯雌酚與微孔中預包被的偶聯抗原競爭己烯雌酚特抗體。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結合的酶標記抗原。加入底物液，結合到板上的酶標記物將底物轉化為有色產物。加入終止液，在450nm處測定吸光度值，吸光度值與試樣中己烯雌酚濃度呈反比。

試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規定的二級水。  

叔丁基甲基醚

乙腈

正己烷

己烯雌酚試劑盒（采用*備案的試劑盒）

4.2.6.1  己烯雌酚系列標準溶液  0ng/mL 、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL

4.2.6.2  酶標板  8條×12孔，包被有偶聯抗原

4.2.6.3  酶標記物

4.2.6.4  己烯雌酚抗體 臨用前將抗體用稀釋了的復溶液按1：11倍稀釋（50mL抗體加500mL復溶液）成的己烯雌酚抗體溶液

4.2.6.5  底物溶液A

4.2.6.6  底物溶液B

4.2.6.7  濃縮洗滌液 臨用前用水將其稀釋20倍作為洗滌液

4.2.6.8  濃縮復溶液 臨用前用水將其稀釋5倍作為稀釋了的復溶液

4.2.6.9  終止溶液

儀器和設備

CSY-E96Y己烯雌酚殘留檢測儀

天平  感量0.01g

分析天平 感量0.00001g

漩渦混合儀

振蕩器

組織勻漿機

冷凍離心機

氮吹儀

離心管  20mL、50mL

微量移液器  單道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50～250mL  

測定步驟

試料的制備

試料的制備包括：

• 取絞碎后的供試樣品,作為供試試料。
• 取絞碎后的空白樣品,作為空白試料。
• 取絞碎后空白樣品,添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試料。

提取和凈化

 取10000r/min勻漿1min的試料（5±0.05）g，置50mL離心管中，加15mL叔丁基甲基醚，渦旋1min，振蕩10min，6000r/min，在-4℃下離心10min，將上層清夜移至雞心瓶中。再加15mL叔丁基甲基醚同法操作，合并兩次上清液，于45℃水浴中減壓旋轉蒸發至干。

加2mL乙腈于雞心瓶中，旋渦溶解殘留物，然后將其轉移至20mL離心管中，再加2mL乙腈同法操作，轉移至同一離心管中。在離心管中加5mL正己烷，渦動60s，15℃，6000 r/min下離心5min，棄去上層液體，再加5mL正己烷于離心管中同法操作，取下層液體，60℃下氮氣吹干，加入1mL稀釋后的復溶液，渦動60s后取50mL加入200mL稀釋后的復溶液，渦動60s，即可作為試樣供分析。

樣品測定程序（20℃～26℃條件下操作）

4.4.3.1  使用前將試劑盒置于室溫（20℃～26℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的酶標板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2℃～8℃。將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均需做兩個平行實驗。

4.4.3.2  加入50 mL標準溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50 mL己烯雌酚抗體溶液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃環境中反應30min。

4.4.3.3  倒出孔中液體，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250mL洗滌液，10s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。

4.4.3.4  加入100mL酶標記物到微孔底部，用蓋板膜封板，25℃環境中反應30min。取出酶標板，如前述洗板5次。

4.4.3.5  加入50mL底物液A和50mL底物液B到微孔中，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色15min。

4.4.3.6  加入50mL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處，測定每孔吸光度值（OD值）。

結果計算和表述

所獲得的標準或樣品吸光度值的平均值除以*個標準（0標準）吸光度值的平均值再乘以100%，

得到以百分比給出的吸光度值，以式（1.1）表示：

百分吸光度值=        ×100%  ………………………………………………………  1.1    

式中:

B—為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；

B₀—為零濃度標準溶液的平均吸光度值。

以標準溶液中己烯雌酚濃度(ng/mL)的自然對數為X軸，百分吸光度值為Y軸，在半對數坐標紙上繪制標準曲線圖。相對應的供試樣品的濃度（ng/mL）可以從標準曲線上查出。也可以求出回歸曲線的方程，計算未知樣品中己烯雌酚的濃度。如果有專業計算機軟件可直接求出供試樣中己烯雌酚的濃度。

注：檢測結果小于1.0μg/ kg時，可判為未檢出，大于1.0μg/ kg時，判為可疑，需用確證法確認。

檢測方法靈敏度、準確度、精密度

靈敏度

本方法在豬肉中的zui低檢出限為1.0μg/kg。

準確度

本方法在豬肉中1.0μg/kg～4.0μg/kg添加濃度的回收率為60.0%～120.0%。

精密度

本方法的批內變異系數CV≤22%； 批間變異系數CV≤15%。

己烯雌酚殘留檢測儀技術參數：

☆波長范圍:300nm-1000nm

☆波長準確度:±2nm

☆吸光度范圍: 0.000~4.000ABS

☆分辨率 :0.001Abs

☆穩定性 : ±0.001A/hr

☆透射比重復性: ≤0.5%T

☆光源 : 進口LED

☆樣品池 : 微孔板