氨基酸的分離與鑒定——雙向層析法

目的要求

（1）、學習雙向紙層析的原理。

（2）、掌握紙層析法分離混合氨基酸的操作方法。

實驗原理

   紙層析是以濾紙作支持物，用一定的溶劑系統展開，使混合樣品達到分析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當溶劑中，點樣在濾紙的一端，再選用適當的溶劑系統，從點樣的一端通過毛細現象向另一端展開，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當的顯色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經展開后某一物質在紙層析譜上的位置常用比移植Rf來表示。

Rf=原點至紙層析斑點中心點的距離→原點至溶劑前沿的距離

    紙層析可看作是溶質（樣品）在固定相與流動相之間的連續抽提，由于溶質在兩相之間的分配系數不同而達到分離。一定的物質在兩相間有固定的分配系數，因而在恒定條件（液劑、pH、溫度）下，各物質有固定的Rf值，據此可達到分析鑒定的目的。

    由于濾紙纖維可吸收20%～25%的水分，且其中6%～7%以氫鍵形式與纖維素上羥基結合，一般條件下難脫去。所以紙層析實際上是以水相作固定相，展開的溶劑作流動相。

    紙層析操作按溶劑展開方向可分為上行、下行和徑向三種。氨基酸分離一般用上行法。上行法又分單向（成分較為簡單的樣品）和雙向（單向時斑點重疊分離不開，于是在其垂直方向用另一種溶劑系統展層）。雙相層析譜可分辨十幾種以上的樣品。

（1）、被分離物質在該溶劑系統中Rf在0.05～0.8之間，且各組分之Rf值相差能大于0.05，以免斑點重疊。

（2）、溶劑系統中任一組分與被分離物之間不能起化學反應。

（3）、被分離物質在溶劑系統中的分配較恒定，不隨溫度而變化，且易迅速達到平衡，這樣所得斑點較圓整。

    本實驗采用八中混合氨基酸為樣品，用酸性和堿性兩種溶劑進行雙向層析，以茚三酮為顯色劑，可獲得分離清晰的層析圖譜。

試劑和器材

1）、試劑

0.1%（w/v）茚三酮丙酮液。

溶劑系統：*相：正丁醇：88%甲酸：水=15:3:2（V/V）。

          第二相：正丁醇：呲啶：98%乙醇：水=5:1:1:1（V/V）。

2）、測試樣品

    標準氨基酸混合溶液：亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、組氨酸、絲氨酸各100mg溶于50mL0.01ml/L鹽酸中。

3）、器材

    層析缸25cm×40cm（×2）；培養皿15cm（×2）；噴霧器；毛細管內徑0.1cm；電吹風；烘箱；層析濾紙12cm×12cm；鉛筆，尺。

操作方法

1）、點樣

    取層析濾紙一張（12cm×12cm），在距紙邊1.2cm處劃一基線，再將紙轉90度，距紙邊1.2cm處作一線與上線垂直。以毛細管吸取混合氨基酸溶液，點與兩線交點處，點的直徑控制在2mm左右，不可過大。待樣品干燥后再點一次。濾紙上點樣斑點干燥后，把濾紙卷成圓筒形，紙的兩邊以鉻絲相連，但不可重疊相碰。

2）、展層

    在層析缸中平穩的放入裝有*相層析溶劑的培養皿。將圓筒形濾紙放入，點樣一段接觸溶劑，以點樣處不浸入溶劑為準。待溶劑自下而上均勻展開，約2h后溶劑到達距紙邊0.5cm處取出濾紙，懸掛于室溫中，用電吹風充分吹近溶劑。然后載去未走過溶劑的濾紙邊緣，將濾紙轉90度，卷成如前圓筒狀，放入盛第二相溶劑的層析缸內展開，約1h后溶劑展開到距紙邊0.5cm時取出，用電吹風吹近溶劑使其干燥。

3）、顯色

    用噴霧器將茚三酮均勻地噴在濾紙上，然后懸濾紙于65℃烘箱內，烘30min，即可看到紫紅色氨基酸斑點，將圖譜上的斑點用鉛筆圈出。用直尺量出各斑點中心與原點的距離以及溶劑前沿與原點的距離，求出各氨基酸的Rf值。將各顯色斑點的Rf值與標準氨基酸的Rf值比較，可得知該斑點的準確成分。

注意事項

（1）、烘箱加熱溫度不可過高，且不可有氨的干擾，否則圖譜背景會泛紅。

（2）、*相溶劑在使用前再按比例混合，否則會引起酯化，影響層析效果。

（3）、整個實驗操作應戴手套進行。