人血清實驗目的:利用基因工程技術,克隆、表達和純化具有生物活性的人脂聯素球狀結構域(gAPN)重組蛋白,建立一種簡便、快捷的檢測人血清脂聯素(APN)濃度的酶聯免疫吸附法(ELISA試劑盒),進一步探討其與冠心病(CHD)的關系。

方法:

1.利用基因克隆技術,構建表達質粒pET22b-gAPN,在原核表達系統大腸桿菌中重組表達、純化人gAPN重組蛋白,并通過觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導的高血糖小鼠模型血糖改變驗證其生物學活性。

2.ELISA試劑盒用抗APN單克隆抗體包被微孔板,10%小牛血清為封閉液,另一針對APN不同抗原表位的單克隆抗體生物素化后作為檢測抗體,聯合生物素-鏈霉親和素信號放大系統,以重組的gAPN蛋白為標準品繪制標準曲線,建立檢測人血清APN濃度的定量ELISA方法。

3.利用建立的ELISA試劑盒方法,檢測161例臨床血清樣本APN水平,經冠狀動脈造影結果確診CHD患者共103例,非CHD患者58例,進一步分析血清APN與CHD發病、冠狀動脈病變狹窄嚴重程度及CHD危險因子之間的關系。

結果:

1.成功構建了pET22b-gAPN質粒,獲得了人gAPN重組蛋白(分子量約15kD),可溶性尚可,產量較高(1.57mg),純度＞90%。Western印跡鑒定其具有抗原活性,且該蛋白具有降低高血糖小鼠模型血糖的生物學活性。

2.成功建立了檢測人血清APN含量的ELISA方法。該檢測方法的靈敏度為150pg/ml,血清檢測準確性、特異性、線性、重復性好,回收率為91.0%-108.0%。相關性良好(r=0.935,P＜0.001)。

3.ELISA試劑盒臨床檢測表明,CHD組APN濃度明顯低于非CHD組[5.67(2.59-10.47)mg/L VS 7.14(4.37-11.40)mg/L,P＜0.01];非CHD組中,女性血清APN濃度高于男性[8.92(5.84-15.53)mg/L VS4.68(3.11-9.05)mg/L,P＜0.01],而在CHD組中,女性血清APN卻低于男性[4.20(1.83-6.05)mg/L VS 5.96(2.71-10.90)mg/L],但差別沒有統計學意義(P＞0.05)。隨著Gensini積分升高,冠狀動脈狹窄程度加重,APN含量降低,但各組間無統計學差異。血清APN濃度與hs-CRP濃度和Gensini積分呈負相關(r=-0.253,r=-0.162,P＜0.05),與HDL-C水平呈明顯正相關(r=0.213,P＜0.01)。

結論:

成功克隆了人gAPN基因,并表達出具有生物學活性的人gAPN重組蛋白;建立了一種簡便、快捷、穩定、可靠的人血清APN定量ELISA檢測方法;臨床實驗證明,CHD患者血清APN水平顯著下降;血清APN濃度與hs-CRP濃度和Gensini積分呈負相關,與HDL-C水平呈正相關,低APN血癥可作為判斷CHD發病的一個指標,具有重要的臨床應用前景。