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上海聯(lián)碩生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第17年
ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作及技術(shù)服務(wù)的常見問(wèn)題分析2012/07/19
一.ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn)的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。1.標(biāo)本的采取和保存大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,應(yīng)注意避免溶血,紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會(huì)
免疫標(biāo)記技術(shù)2012/07/19
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉酶免疫技術(shù)基本原理和方法、免疫熒光技術(shù)的基本原理。2、了解酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(間接法)的基本過(guò)程及其作用。目前應(yīng)用zui多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),它是使抗原或抗體吸附于固相載體,使隨后進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)均在載體表面進(jìn)行,從而簡(jiǎn)化了分離步驟,提高了靈敏度,即可檢測(cè)抗原,也可檢測(cè)抗體。實(shí)驗(yàn)方法包括間接法、夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法。為了檢測(cè)抗原可用夾心法。將特異性抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯制成的小管、小盤或小孔)上,然后加被測(cè)溶液,倘樣品中有相應(yīng)抗原,則與抗體在載體表面形成
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)操作要點(diǎn)2012/07/19
標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液),有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外,在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)
多克隆抗體的免疫電泳技術(shù)2012/07/19
多克隆抗體的免疫電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理】免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術(shù),這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM,IgG,IgA含量水平的實(shí)驗(yàn)方法。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中,首先利用蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷的比值運(yùn)用水平瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中,在抗原和抗體的擴(kuò)散過(guò)程中,抗原和抗體適當(dāng)比例的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致沉淀的產(chǎn)生。0.85%鹽不僅可以終止擴(kuò)散過(guò)程也可用于洗去未結(jié)合的蛋白,抗原和抗體結(jié)合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。免
多克隆抗體的概念及制備流程2012/07/19
多克隆抗體的概念及制備流程多克隆抗體科技名詞定義中文名稱:多克隆抗體英文名稱:polyclonalantibody定義1:由多個(gè)B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體,可與不同抗原表位結(jié)合且免疫球蛋白類別各異。所屬學(xué)科:免疫學(xué)(一級(jí)學(xué)科);免疫系統(tǒng)(二級(jí)學(xué)科);免疫分子(三級(jí)學(xué)科)定義2:對(duì)特定抗原所產(chǎn)生的一組免疫球蛋白混合物,每種免疫球蛋白能識(shí)別抗原分子上的一個(gè)表位。所屬學(xué)科:生物化學(xué)與分子生物學(xué)(一級(jí)學(xué)科);總論(二級(jí)學(xué)科)定義3:多種抗原表位刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)后,機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)不同抗原表位的混合抗體。所屬學(xué)
ELISA 的概念、原理、操作步驟2012/07/19
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái),發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。(一)ELISA是酶原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過(guò)洗滌除去多
ELISA 的操作要點(diǎn)2012/07/19
ELISA的操作要點(diǎn)的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。1標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,體液、分泌物和排泄物)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液),有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外,在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作
ELISA 常見問(wèn)題2012/07/19
ELISA常見問(wèn)題ELISA操作常見問(wèn)題ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外,有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有:①標(biāo)本因素;②試劑因素;③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析。1.樣品稀釋酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),如果血清不稀釋,不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此,國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒,均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),以
膠體金技術(shù)2012/07/19
膠體金技術(shù)膠體金技術(shù)是七十年代推出的一門檢測(cè)技術(shù),廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,目前已成為一種常用的檢測(cè)技術(shù)。膠體金技術(shù)是以微孔膜作為固相,固相膜有很多孔,像濾紙一樣,常用的固相膜為硝酸纖維素膜,液體可以穿過(guò)流出,也可以通過(guò)毛細(xì)管作用在膜上向前移動(dòng)。利用這兩種性能建立了兩種不同類型的快速檢測(cè)方法,前者叫免疫滲濾試驗(yàn),后者叫免疫層析試驗(yàn),兩者統(tǒng)稱為“金標(biāo)”。膠體金也稱金溶膠,是由金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。膠體金具有膠體性質(zhì)、呈色性及光吸收性。因此可通過(guò)肉眼觀察結(jié)果,是zui簡(jiǎn)單、方便的
酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇2012/04/09
酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇在免疫酶技術(shù)中,首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化,便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外,由于濃度過(guò)高,可使非特異性反應(yīng)增加,而濃度過(guò)低又可影響測(cè)定的敏感性。因此,正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。(一)酶標(biāo)記抗體的滴定方法:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng),以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來(lái)確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià),或稱工作濃度。(二)步驟:先將抗原(或抗體)
HRP標(biāo)記抗體之簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法2012/04/09
HRP標(biāo)記抗體之簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結(jié)合,所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高,將近70%的HRP和Ig結(jié)合,99%的Ig與酶結(jié)合,酶與Ig的活性無(wú)重大損失,是目前zui常用的方法。1.原理經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來(lái)Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連,形成斯夫氏鹼,
Folin-酚試劑法(又名Lowry)法2011/12/23
Folin-酚試劑法(又名Lowry)法Folin-酚試劑法zui早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),要控制操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)多。Folin-酚試劑法同時(shí)也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可測(cè)定范圍是20~250mg,檢測(cè)的zui低蛋白量可達(dá)5mg。Folin-酚法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,
蛋白質(zhì)的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)2011/12/23
蛋白質(zhì)的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)定量是生物化學(xué)、食品檢驗(yàn)和其它生命學(xué)科zui常涉及的分析內(nèi)容,是臨床診斷的重要指標(biāo),也是許多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。生化實(shí)驗(yàn)中,在對(duì)生化藥品,特別是蛋白質(zhì)、酶、某些多肽或蛋白質(zhì)激素的分離純化時(shí),對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析是非常重要的。然而蛋白質(zhì)的種類很多,結(jié)構(gòu)不均一,分子量又相差很大,功能各異,這給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了很大的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種,不同的方法各有其特點(diǎn)。紫外分光光度法是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)來(lái)
凱氏定氮法2011/12/23
凱氏定氮法凱氏定氮法是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下,用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)銨鹽,然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨,隨水蒸氣餾出并為過(guò)量的酸液吸收,再以標(biāo)準(zhǔn)堿滴定,就可計(jì)算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定,可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量,故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。凱氏定氮法是基于待測(cè)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí),會(huì)被氧化成為二氧化碳和水,然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),即為蛋白質(zhì)含量。1.有機(jī)
血漿置換簡(jiǎn)介2011/12/23
血漿置換簡(jiǎn)介血漿置換是血液凈化療法之一。其方法是用血細(xì)胞分離機(jī)將全血分離成血漿和細(xì)胞成分(紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板),然后根據(jù)臨床需要,將患者全血漿或血漿的亞成分或某種細(xì)胞成分去除,并用健康人血漿或血漿代用品予以替補(bǔ),以達(dá)到治療疾病的目的。血漿置換液一般是正常人的血漿。如果血漿來(lái)源緊張,特別是遇突發(fā)大規(guī)模公共醫(yī)療事件,需要大量血漿時(shí),可以部分使用706代血漿,或者用生理鹽水加白蛋白代替血漿,以緩解血漿來(lái)源的不足。血漿置換的量一般根據(jù)病情而定,通常以置換2000ml為宜。若患者病情嚴(yán)重,可反復(fù)做2~
血漿置換的作用機(jī)制及方法2011/12/23
血漿置換的作用機(jī)制及方法1、血漿置換的作用機(jī)制血漿置換可以有效地清除疾病相關(guān)性因子,如抗體、免疫復(fù)合物、同種異體抗原或改變抗原、抗體之間量的比例。這也是PE治療的主要機(jī)制。PE對(duì)致病因子的清除要較口服或靜脈內(nèi)使用免疫抑制劑迅速而有效。血漿置換還有非特異性的治療作用,可降低血漿中炎性介質(zhì)如補(bǔ)體產(chǎn)物、纖維蛋白原的濃度,改善相關(guān)癥狀。同時(shí)血漿置換還可以增加吞噬細(xì)胞的吞噬功能和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除功能。此外機(jī)體還可從置換液中補(bǔ)充機(jī)體所需物質(zhì)。應(yīng)該說(shuō)明的是,血漿置換治療不屬于病因治療,因而不影響疾病的基本病理
HRP標(biāo)記抗體之戊二醛二步法2011/12/23
HRP標(biāo)記抗體之戊二醛二步法1.原理戊二醛為一種雙功能試劑,通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。2.試劑及器材(1)0.1MPH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。(2)1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。(3)1MPH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。(4)0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨
抗體的親和層析法純化技術(shù)2011/12/23
抗體的親和層析法純化技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理】如圖所示,親和層析的高度選擇性使得從某一初始材料中純化,富集某一含量較低的目的蛋白成為可能,因此親和層析是蛋白質(zhì)分離純化過(guò)程中zui有效的方法之一。另外,如果配基與蛋白質(zhì)的親和能力很強(qiáng),也可同時(shí)進(jìn)行樣品的濃縮。雖然多數(shù)情況下不需要將抗體與其他血清蛋白分開,但如果一旦需要,蛋白A親和層析是一種非常有效的分離方法。蛋白A是從Staphylococcusaureus中獲得,可與抗體重鏈的Fc片段相結(jié)合。現(xiàn)在已知蛋白A可與多種哺乳動(dòng)物的IgG相結(jié)合也可與某些IgM和Ig
ABC-ELISA材料和方法2011/09/27
BAS酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)材料和方法(以篩選抗空腸彎曲菌共同抗原的單克隆抗體為例)1材料(1)空腸彎曲菌共同抗原提取物,自制。(2)生物素化羊抗鼠IgG(BSAMG),衛(wèi)生部上海生物制品所。(3)ABC試劑,衛(wèi)生部上海生物制品所。如ABC試劑需自己配制,可按說(shuō)明要求,將親和素與酶標(biāo)生物素按一定比例混合,置37℃孵育30min后使用。(4)被檢雜交瘤培養(yǎng)物上清液。(5)其他試劑及器材同常規(guī)ELISA法。2方法ABCELISA間接法程序(1)用包被液對(duì)空腸彎曲菌共同抗原提取物作適當(dāng)稀釋(1∶16),加入
J.Immuno.:細(xì)菌提高免疫系統(tǒng)的機(jī)制2010/09/15
科學(xué)家很早就知道某些特定類型的細(xì)菌能夠提高免疫系統(tǒng)。現(xiàn)在芝加哥洛約拉大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌執(zhí)行這項(xiàng)重要任務(wù)的機(jī)制。文章的*作者KatherineL.Knight博士和她的同事在6月15日的JournalofImmunology雜志上發(fā)表了這項(xiàng)研究結(jié)果。KatherineL.Knight是洛約拉大學(xué)斯特里奇醫(yī)學(xué)院微生物和免疫學(xué)系主任。人體中含有大量的細(xì)菌,在我們每個(gè)人體內(nèi),細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量大約是人體細(xì)胞的10倍。細(xì)菌可以生活在人體皮膚,呼吸道,消化道等地方。單獨(dú)消化道就大概是500至1000種細(xì)菌
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