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生物化學技術專題：蘆丁的提取及鑒定2014/01/09

概述蘆?。≧utin）廣泛存在于植物界中，現已發現含蘆丁的植物至少在70種以上，如煙葉、槐花、蕎麥和蒲公英中均含有。尤以槐花米（為植物Sophorajaponica的未開放的花蕾）和蕎麥中含量zui高，可作為大量提取蘆丁的原料。蘆丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羥基與蕓香糖（Rutinose）〔為葡萄糖（Glucose）與鼠李糖（Rhamnose）組成的雙糖〕脫水合成的苷。蘆丁為淺黃色粉末或極細的針狀結晶，含有三分子的結晶水，熔點為174~178℃，無水物188~190℃。溶解度：冷水

生物化學技術專題：氨基轉移反應的定性鑒定2014/01/07

一、實驗目的（1）學習一種鑒定氨基轉移作用的簡便方法及其原理；（2）進一步掌握紙層析的原理和操作技術；（3）了解氨基轉移作用在中間代謝中的意義。二、實驗原理氨基移換酶也稱轉氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換，這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內蛋白質的合成與分解等中間代謝中，在糖、脂肪、蛋白質三類物質代謝的相互、相互轉化上，都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進行轉氨作用時，都由其專一的轉氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉氨酶中，以谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶（簡稱谷

生物化學技術專題：PPO活性測定2014/01/07

一、原理與方法PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實驗是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410nm處使反應體系的OD值產生變化，通過OD值上升的讀數變化確定PPO的酶活大小。其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預熱后加入0.05ml酶液，反應5分鐘，在分光光度計410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以

生物化學技術專題：掌葉防己堿的提取與分離及延胡索乙素制備2014/01/07

掌葉防已堿又稱巴馬?。╬almatine），硫酸延胡索乙素又稱消旋四氫巴馬汀硫酸鹽（dltetrahydropalmatinesulphate）。延胡索乙素（CorydalisB）為鎮靜安定藥，用于緩解胃系統的疾病所引起的疼痛，臨產陣痛、頭痛、失眠等。中藥延胡索（元胡，CorydalisyanhusuoW.T.Wang的塊根）中含延胡索乙素的量很少，而其脫氫化合物巴馬汀在某些植物中含量卻很高。在中國華南一帶的防已科植物黃藤（Fibreursarecisapaerre）的根莖中含巴馬汀，再經氫化反

生物化學技術專題：微生物的糖發酵2014/01/07

一、單糖發酵試驗(一)、實驗原理單糖發酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養基內，使其zui終濃度為0.75~1％。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發酵管，接種細菌經37℃培養18~24小時，若能分解糖產酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有CO2和H2等氣體形成，小倒管內則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。(二)、實驗材料1．菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2．培養基：葡萄糖發酵管，乳糖發酵管等。(三)實驗方法1．將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分

蛋白質技術專題：細胞凋亡的幾種檢測方法2014/01/07

一、形態學觀察方法1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。2、丫啶橙(AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨

蛋白質技術專題：核蛋白的免疫熒光定位實驗2013/12/23

標簽：核蛋白免疫熒光定位免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展zui早的一種免疫熒光技術。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。實驗方法免疫熒光定位法實驗方法原理免疫熒光細胞化學技術是采用熒光素標記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素發出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質，并可利用熒光定量技術計算抗原的含量，以達

蛋白質技術專題：ELISA的操作要點2013/12/23

的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內醫學檢驗一般均用板式點。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應用，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規定操作，必能得出準確的結果。一、標本的采取和保存可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血

蛋白質技術專題：凝膠過濾層析實驗2013/12/23

標簽：凝膠過濾層析凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography）法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。實驗方法蛋白質的凝膠過濾分離實驗材料蛋白質試劑、試劑盒凝膠過濾緩沖液儀器、耗材布氏漏斗凝膠過濾層析柱分光光度計實驗步驟1.如果凝膠過濾的介質是干粉，則需在凝膠過濾緩沖液中*溶脹。2.在遠離過往通道及直接光照的恒

蛋白質技術專題：蛋白質的電轉實驗2013/12/23

標簽：蛋白質電轉很多膜可作為蛋白質電轉移的固相支持物，如重氮化纖維素膜（DPT，DBM）、DEAE-纖維素膜、尼龍膜等，但用的zui多的還是硝酸纖維素膜（NC膜），該膜與蛋白質以非共價的疏水作用形式結合，結合能力約為80μg/cm2。實驗方法基本方案實驗材料蛋白質試劑、試劑盒轉移緩沖液甲醇電極緩沖液儀器、耗材電轉移槽電泳儀實驗步驟1.剪6塊3MM濾紙和一塊NC膜。2.將剪好的3MM濾紙和NC膜在轉移緩沖液中浸泡3-5分鐘。3.按下列過程安裝轉移裝置，將塑料支架平放在含轉移緩沖液的托盤中，在塑料支

蛋白質技術專題：蛋白質回收實驗2013/12/17

標簽：蛋白質回收試驗，是“對照試驗”的一種。當所分析的試樣組分復雜，不*清楚時，向試樣中加入已知量的被測組分，然后進行測定，檢查被加入的組分能否定量回收，以判斷分析過程是否存在系統誤差的方法。所得結果常用百分數表示，稱為“百分回收率”，簡稱“回收率”。實驗方法基本方案實驗材料蛋白質試劑、試劑盒SDSDTT脫色液染色液儀器、耗材電泳儀透析膜實驗步驟1.凝膠浸泡在染色液中于室溫緩慢搖動染色15~20min，然后移至脫色液中于4℃溫和搖動下脫色2~3h。2.切下染色后的凝膠條帶，于4℃水中浸泡2~3h

蛋白質技術專題：谷胱甘肽-S-轉移酶活性測定2013/12/17

谷胱甘肽S-轉移酶是指催化具有親電取代基的外源性化合物與內源的還原谷胱甘肽(GSH)反應的酶?？纱呋喾N反應包括烴基、芳基、芳烴基、烯基和氧基的轉移反應。谷胱甘肽S-轉移酶是谷胱甘肽結合反應的關鍵酶，催化谷胱甘肽結合反應的起始步驟，主要存在于胞液中。谷胱甘肽S-轉移酶有多種形式，根據作用底物不同，至少可分為下列5種：1、谷胱甘肽S-烷基轉移酶：催化烷基鹵化物和硝基烷類化合物的谷胱甘肽結合反應。主要存在于肝臟和腎臟。2、谷胱甘肽S-芳基轉移酶：主要催化含有鹵基或硝基的芳烴類或其它環狀化合物的谷胱甘

蛋白質技術專題：鎘--血紅素法測定組織水平金屬硫蛋白2013/12/17

金屬硫蛋日(metallothionein，MT)是富含金屬及硫的可誘導性蛋白，它可被某些金屬(Bi，Zn，Cu等)、激素（糖皮質激素）、細胞毒藥物（順鉑及烷化劑）及其他與物理化學刺激相關的病理生理狀況所誘導。MT廣泛存在于哺乳婁動物除結締組織外的幾乎所有組織中，肝、腎、胰、腸中zui為豐富，從已有的研究中發現：MT增加可介導腫瘤細胞對烷化劑及DDP產生耐藥性。耐DDP的細胞MT含量增加且MTmRNA過度表達。DDP耐藥表型的逆轉伴隨MT含量增加且MTmRNA過度表達；用編碼MT的真核細胞表達載

蛋白質技術專題：免疫篩選實驗2013/12/17

標簽：免疫篩選根據抗原-抗體相互作用的原理從群體中選出目的物的技術。如用抗體檢測表達型的基因文庫所合成的蛋白質，從而篩選出目的基因的克隆。實驗方法基本方案實驗材料cDNA試劑、試劑盒BHI氯霉素NaOHSSC氯仿異戊醇TESSDSmRNA甲硫氨酸乙醇乙酸鈉免疫沉淀緩沖液儀器、耗材轉子硝酸纖維濾膜離心管微量多孔洗滌儀實驗步驟1.往微量滴定板的每孔中加入250μl含適當抗生素的選擇性BHI培養液，并分別接種獨立的cDNA克隆，37℃溫育過。2.在250ml燒瓶中加入50mlBHI/抗生素培養液，以1

蛋白質技術專題：豆粕中尿素酶活性的測定2013/12/17

一、實驗目的掌握測定尿素酶活性的各種方法的基本原理及方法步驟。二、實驗原理將粉碎的大豆制品與中性尿素緩沖溶液混合，在30℃保持30min后，尿素酶催化尿素水解產生氨的反應。用過量的鹽酸溶液中和所產生的氨，再用氫氧化標準溶液回滴。三、實驗設備1、樣品篩：孔徑200μm；2、酸度計：精度0.02pH，附有磁力攪拌器和滴定裝置；3、恒溫水?。嚎煽販?0±0.5℃；4、試管：直徑18mm，長150mm，有磨口塞子；5、精密計時器；6、粉碎機：粉碎時應不生強熱（如球磨機7、分析天平．感量0.1mg；8、移

蛋白質技術專題：蛋白質的提取及粗分離實驗2013/12/11

標簽：蛋白質提取粗分離分離純化蛋白質，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質，zui后進行精細分離，得到目的蛋白。本實驗以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。實驗方法硫酸銨鹽析法實驗方法原理分離純化蛋白質，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質，zui后進行精細分離，得到目的蛋白。本實驗以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。TNF的提取是將發酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出

蛋白質技術專題：離子交換色譜2013/12/11

4，洗脫方式的選擇,離子交換色譜洗脫方式有三種：一是改變緩沖液pH，使蛋白質從吸附狀態變為解吸附狀態。如在陰離子交換色譜中，通過降低流動相pH使吸附在柱子上的帶負電荷的蛋白質帶正電，從而達到解吸附，在陽離子交換色譜中則是通過升高流動相pH的方法達到解吸附；二是增加緩沖液的離子強度，將吸附強的分子從離子交換劑上替換下來；三是緩沖液pH和離子強度同時改變。無論哪一種方法，都可用階段洗脫和梯度洗脫兩種方式進行。階段洗脫是用幾個不同pH緩沖液或幾個不同鹽濃度的緩沖液逐步進行洗脫。即pH和離子強度變化不連

蛋白質技術專題：液相色譜之排阻液相色譜2013/12/11

液相色譜（HighRerformanceLiquidChromatography,HPLC）又叫高壓、高速、近代液相色譜，通常叫做液相色譜。它是60年代中期才建立的一種快速分離化合物的方法，到了70年代后期才廣泛用于蛋白質的分離純化方面，現已成為分離純化蛋白質非常有效的方法之一。和經典常壓色譜相比它有以下特點：1、HPLC分離、純化蛋白質的速度快。通常半小時左右可進行一次，大大縮短了純化蛋白質的時間；2、分辯率高。一根長10cm的色譜柱可分離十幾種以上的物質；3、適應面廣，靈活性強，幾乎所有的蛋

蛋白質技術專題：TNF-α生物學活性檢測方法2013/12/11

基本原理TNF的生物學活性之一是能直接殺傷腫瘤細胞。TNF與相應受體結合后向細胞內移，被靶細胞溶酶體攝取導致溶酶體穩定性降低，各種酶外泄，引起細胞溶解。腫瘤細胞株對TNF-α的敏感性有很大的差異，用放線菌素D、絲裂酶素C、放線菌酮等處理腫瘤細胞，可明顯增強TNF-α殺傷腫瘤細胞活性。材料和試劑1，*培養基（1）10%FCS-DMEM培養液（V/V）。2，*培養基（2）3%FCS-DMEM培養液（V/V）0.5-1μg/ml放線菌素-D。3，0.05%結晶紫溶液：取50mg結晶紫，用20ml無水乙

蛋白質技術專題：磷酸氨基酸分析實驗2013/12/11

標簽：磷酸氨基酸分析鑒定蛋白質中磷酸化的氨基酸殘基是很有意義的。磷酸化作用發生在蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸和酩氨酸時，通過部分的HCl水解及接著進行雙向薄層電泳，可以便利地鑒定標記的磷酸氨基酸。實驗方法酸水解法實驗材料磷酸化蛋白質試劑、試劑盒印度墨汁HCl磷酸氨基酸混合物電泳緩沖液茚三酮儀器、耗材PVDF膜烘箱離心機離心管纖維素薄層色譜濾紙薄層電泳儀實驗步驟1.放射性標記的磷酸化蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行制備電泳。電轉移至PVDF膜上，用水洗膜數次，不要讓膜變干。2.用30~50ml印度墨