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【感受態(tài)細(xì)胞的制備】用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞2013/05/15: 1.從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min），每隔20~30min測(cè)量OD600值≈0.4。2.在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10~20min。3.于4℃4000轉(zhuǎn)/分離心10min，回收細(xì)菌細(xì)胞。4.將管倒置1min，以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5.以10

【感受態(tài)細(xì)胞的制備】電擊和熱擊感受態(tài)細(xì)胞的制備2013/05/15: 實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，搖床，離心機(jī)，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌，農(nóng)桿菌和假單胞桿菌實(shí)驗(yàn)步驟1.電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農(nóng)桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養(yǎng)基，37℃（大腸桿菌）或者28

細(xì)胞表面抗原染色2013/04/24: 細(xì)胞表面分子流式檢測(cè)步驟說明注意事項(xiàng)1．在使用抗體之前，快速甩動(dòng)一下，使之聚集到管的底部；2．熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光保存在4℃，不要冷凍；3．當(dāng)染色的時(shí)候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號(hào)。為了得到更好的結(jié)果，染色后應(yīng)該馬上分析。過程概述：1．制作外周血、淋巴組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；2．細(xì)胞染色抗體（包括直接標(biāo)記抗體和間接標(biāo)記抗體）；3．洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑4．運(yùn)行分析流式儀。注意：流式細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化都很重要。關(guān)鍵參數(shù)包括靶細(xì)胞、抗體效價(jià)以及動(dòng)力學(xué)。試

流式胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)方法2013/04/24: 方案A：兩步法胞內(nèi)（細(xì)胞質(zhì)）蛋白染色。方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）。注意：1、不同細(xì)胞因子的刺激條件是不同的，比如：LPS刺激活化單核細(xì)胞分泌IL-6的培養(yǎng)時(shí)間一般是6個(gè)小時(shí)，而檢測(cè)IL-10則需要刺激24小時(shí)。2、結(jié)合熒光的流式抗體應(yīng)在4度，避光儲(chǔ)存。3、使用抗體前請(qǐng)低速離心30秒，使貼壁抗體沉底。不建議斡旋混勻抗體，可用手指輕彈混勻。4、除非方案中注明，默認(rèn)的抗體孵育方法是冰上或4度避光。5、緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。方案A:兩步法胞內(nèi)（細(xì)胞質(zhì)）蛋白染

流式表面抗原染色方法2013/04/24: 方案A：細(xì)胞懸液的表面抗原染色。方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）。小貼士：1、流式抗體要儲(chǔ)存于避光4度，嚴(yán)格避免凍融。2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請(qǐng)勿斡旋混勻。3、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進(jìn)行改善。方案A:細(xì)胞懸液的表面抗原染色實(shí)驗(yàn)材料：15×75mm圓底流式管或96孔板直標(biāo)一抗或純化抗體二抗（可選）抗小鼠CD32/16抗體（eBioscienceCat.No.14-0161）人FC?R結(jié)合抑制劑（eBioscienc

流式檢測(cè)細(xì)胞樣品的制備2013/04/24: 方案A：組織培養(yǎng)細(xì)胞的制備。方案B：淋巴組織細(xì)胞制備。方案C：非淋巴組織細(xì)胞制備。方案D：全血PBMC的分離。小貼士1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)需要將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。2、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。3、實(shí)體組織制備單細(xì)胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進(jìn)行，具體組織的方法，依照經(jīng)驗(yàn)來進(jìn)行。方案A:組織培養(yǎng)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)材料：Accutase™酶細(xì)胞分離培養(yǎng)基（eBioscienceCat.No.00-4555）eBioscience®流式染色緩沖液（eBioscienceCat.No.00-42

CaspGlow 實(shí)驗(yàn)參考方案2013/04/24: 以CaspGLOW™FluoresceinActiveCaspase-3StainingKit（88-7004）為例。1.根據(jù)文獻(xiàn)中方法誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，準(zhǔn)備未誘導(dǎo)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，另外一種陰性對(duì)照用1ulZ-VAD-FMK抑制劑制備。2.將細(xì)胞加入300ul*培養(yǎng)基中，濃度為1×106.3.加1ulFITC-DEVD-FMK在5%CO237攝氏度下孵育30~60min.4.3000rpm，5min,移去上清。5.加入0.5mlwash-buffer洗滌細(xì)胞一次。6.重復(fù)步驟4和步驟5.7.流式細(xì)

各種細(xì)胞免疫檢測(cè)方法比較2013/04/15: 類型檢測(cè)名稱檢測(cè)方法主要特點(diǎn)體內(nèi)功能檢驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)法皮下注射抗原或者負(fù)載抗原的DC，觀察紅斑、硬塊的發(fā)生與大小優(yōu)點(diǎn)：體內(nèi)功能性檢驗(yàn)，相對(duì)比較容易操作；缺點(diǎn)：只是一種初篩，加陽(yáng)性與假陰性比較嚴(yán)重。體外表型檢測(cè)TCR可變區(qū)分析法使用針對(duì)T細(xì)胞受體（TCR）可變區(qū)的流式抗體來對(duì)表達(dá)特定可變區(qū)的T細(xì)胞計(jì)數(shù)優(yōu)點(diǎn)：可以提供關(guān)于可變區(qū)使用的群體分布；缺點(diǎn)：識(shí)別同一種抗原的TCR的可變區(qū)可能不相同；單抗不夠豐富，不能檢測(cè)所有種類的可變區(qū)。多肽MHC四聚體法（Tetramer）用熒光標(biāo)記的MHC-肽四聚體去結(jié)

重組細(xì)胞因子溶解小帖士2013/04/15: 1．離心（Centrifuge）：高速離心（10,000rpm）20-30秒，或低速離心（2,000rpm）5分鐘。2．溶解（Reconstitution）：用去離子水或其它緩沖液（根據(jù)說明書要求進(jìn)行選擇）溶解至說明書要求的濃度（一般為0.1-1.0mg/ml）。溶解時(shí)不可振蕩，避免因化學(xué)鍵的斷裂造成蛋白失活，可加入適當(dāng)?shù)娜軇┹p搖并靜置一段時(shí)間，待細(xì)胞因子*溶解后使用。溶劑的選擇：1）要求用去離子水溶解的產(chǎn)品，務(wù)必不可用鹽溶液，避免過高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出；2）要求用鹽溶液溶解的產(chǎn)品，請(qǐng)

PeproTech重組細(xì)胞因子常見問題解答2013/04/15: PeproTech公司的重組細(xì)胞因子產(chǎn)品經(jīng)過了十分嚴(yán)格的生產(chǎn)、純化及質(zhì)檢過程，保證其在投放市場(chǎng)之前，達(dá)到如下要求：1.真實(shí)性：重組蛋白產(chǎn)品一致經(jīng)過N末端氨基酸序列分析；必要時(shí)應(yīng)用SDS-PAGE,RP-HPLC和質(zhì)譜（MS）檢測(cè)其真實(shí)性。2.純度：應(yīng)用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析產(chǎn)品純度。3.生物活性：進(jìn)行相應(yīng)的體外（invitro）或體內(nèi)（invivo）活性檢測(cè)。4.蛋白含量：通過紫外光譜分析，SDS-PAGE電泳檢測(cè)；必要時(shí)應(yīng)用HPLC定量標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。5.內(nèi)毒素：kinetic

抗原修復(fù)技術(shù)在免疫組化中的應(yīng)用2013/04/15: 福爾馬林固定時(shí)，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時(shí)，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當(dāng)部分的抗原不能與抗體很好是進(jìn)行反應(yīng)。因此，抗原修復(fù)也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素。抗原修復(fù)（Antigenretrieval，AR）技術(shù)，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學(xué)研究，經(jīng)1991年shi等人[2]發(fā)展。抗原修復(fù)是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)（IHC）前

RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用2013/04/15: RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡2013/04/02: 細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH

DNA的片斷化檢測(cè)2013/04/02: 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長(zhǎng)的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNAladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNAlad

線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)2013/04/02: 線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中zui早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarb

磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）2013/04/02: 磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中（圖3）。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一種核酸染料，它不能

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)2013/04/02: 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡與壞死是兩種*不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，下面介紹幾種常用的測(cè)定方法。一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、

2013年P(guān)ierce蛋白組學(xué)新產(chǎn)品推薦2013/03/19: 2013年P(guān)ierce蛋白組學(xué)新產(chǎn)品為了更好地推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，ThermoScientificPierce推出了一系列產(chǎn)品。這些產(chǎn)品都是根據(jù)Pierce使用者的實(shí)際反饋意見來進(jìn)行設(shè)計(jì)的，將給您的實(shí)驗(yàn)帶來更大的便利。2013年我們將不斷推出產(chǎn)品的*方案以及更多的應(yīng)用數(shù)據(jù)，敬請(qǐng)期待。細(xì)胞活性和基因調(diào)控檢測(cè)PierceLDHCytotoxicityAssayKit—簡(jiǎn)單、可靠的比色檢測(cè)試劑盒,可用于細(xì)胞毒性的定量分析alamarBlueCellViabilityAssayReagent—快速

R&D Systems DuoSet® ELISA Kit 選購(gòu)注意事項(xiàng)2013/03/19: 一、什么樣的客戶適合選用DuoSetELISA?主要為客戶篩選高通量的指標(biāo)而設(shè)計(jì)的，適合熟悉ELISA研發(fā)的實(shí)驗(yàn)人員使用。沒有ELISA經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行ELISA檢測(cè)的客戶不建議使用。二、DuoSetELISAKit里面一共有多少塊板子？1個(gè)DuoSet試劑盒包含的試劑可以滿足大約15塊96孔微孔板的檢測(cè)。三、DuoSetELISAKit檢測(cè)的樣本類型是什么？檢測(cè)樣本類型：細(xì)胞培養(yǎng)的上清液熟悉ELISA研發(fā)的實(shí)驗(yàn)人員已成功將其推廣到血清和血漿樣本的使用。如果要決定試劑盒是否可用于組織勻漿（或其它未經(jīng)檢

磁珠式菌種保藏管使用方法2013/03/19: 我公司代理加拿大PULSE的菌種保藏管產(chǎn)品。其使用方法圖示如下：

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