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7倍靈敏度 熒光顯身手 顯微技術(shù)迎來新跨越
2021年01月11日 14:41:02
來源：中國科學(xué)報 作者：唐鳳 點(diǎn)擊量：3944
2021年伊始，顯微鏡技術(shù)也迎來新的跨越。光物理學(xué)家開發(fā)出一種新方法，利用現(xiàn)有顯微鏡技術(shù)，無需添加染色劑或熒光染料，就能更詳細(xì)地觀察活細(xì)胞內(nèi)部。一種熒光壽命顯微鏡技術(shù)，能夠使用頻率梳而不是機(jī)械部件來觀察動態(tài)生物現(xiàn)象。
【化工儀器網(wǎng) 科技前沿】日本東京大學(xué)研究人員開發(fā)了一種方法，可以提高現(xiàn)有定量相位成像的靈敏度，同時看到活細(xì)胞內(nèi)從微小顆粒到大型結(jié)構(gòu)的所有結(jié)構(gòu)。
2021年伊始，顯微鏡技術(shù)也迎來新的跨越。
光物理學(xué)家開發(fā)出一種新方法，利用現(xiàn)有顯微鏡技術(shù)，無需添加染色劑或熒光染料，就能更詳細(xì)地觀察活細(xì)胞內(nèi)部。
一種熒光壽命顯微鏡技術(shù)，能夠使用頻率梳而不是機(jī)械部件來觀察動態(tài)生物現(xiàn)象。
“我認(rèn)為無標(biāo)簽技術(shù)將是一個重要的研究方向。特別是以無標(biāo)簽的方式對細(xì)胞內(nèi)外病毒和外來體等小顆粒進(jìn)行測量的技術(shù)將是未來成像設(shè)備的一個趨勢。”其中一項(xiàng)研究的領(lǐng)導(dǎo)者、日本東京大學(xué)光子科學(xué)與技術(shù)研究所副教授Takuro Ideguchi在接受《中國科學(xué)報》采訪時表示。
更大范圍 更小相位變化
由于單個細(xì)胞幾乎是半透明的，因此顯微鏡照相機(jī)必須能探測到穿過部分細(xì)胞的光線的極其細(xì)微的差異。這些差異被稱為光的相位。相機(jī)圖像傳感器則受到它們能檢測到的光相位差的限制，即動態(tài)范圍。
“為了使用同一圖像傳感器看到更詳細(xì)的信息，我們必須擴(kuò)大動態(tài)范圍，這樣就可以探測到更小的光相位變化。”Ideguchi說，“更大的動態(tài)范圍允許我們測量小型和大型的相位圖像。例如，如果測量一個細(xì)胞，細(xì)胞的主干會產(chǎn)生大的相位變化，而細(xì)胞內(nèi)的小顆粒/分子會產(chǎn)生小的相位變化。為了使兩者可視化，我們必須擴(kuò)大測量的動態(tài)范圍。”
該研究小組開發(fā)了一種技術(shù)，通過兩次曝光分別測量光相位的大小變化，然后將它們無縫連接起來，制造出詳細(xì)的終圖像。他們將這種方法命名為自適應(yīng)動態(tài)范圍偏移定量相位成像(ADRIFT-QPI)。相關(guān)論文近日發(fā)表于《光：科學(xué)與應(yīng)用》。
一直以來，定量相位成像是觀察單個細(xì)胞的有力工具，它允許研究人員進(jìn)行詳細(xì)的測量，比如根據(jù)光波的位移跟蹤細(xì)胞的生長速度。然而，由于圖像傳感器的飽和容量較低，該方法無法跟蹤細(xì)胞內(nèi)及周圍的納米顆粒。
而新方法克服了定量相位成像的動態(tài)范圍限制。在ADRIFT-QPI中，相機(jī)需要兩次曝光，并產(chǎn)生一個終圖像，其靈敏度是傳統(tǒng)定量相顯微鏡的7倍。
兩次曝光 告別光毒
第一次曝光是用常規(guī)的定量相位成像產(chǎn)生的——平的光脈沖指向樣品，并在它通過樣品后測量光的相移。計(jì)算機(jī)圖像分析程序基于第一次曝光的圖像，快速設(shè)計(jì)一個反射樣品圖像。然后，研究人員用一個叫做波前整形裝置的獨(dú)立組件，用更高強(qiáng)度的光產(chǎn)生一種“光雕塑”，以獲得更強(qiáng)的照明，并向樣品發(fā)出脈沖，進(jìn)行第二次曝光。
如果第一次曝光產(chǎn)生的圖像是樣品的完美代表，第二次曝光的雕刻光波將以不同的相位進(jìn)入并穿過樣品，終只能看到一個黑暗的圖像。
“有趣的是，我們在某種程度上抹去了樣本的圖像。實(shí)際上，我們幾乎什么都不想看到。我們?nèi)サ袅舜蟮慕Y(jié)構(gòu)，這樣就能看到小的細(xì)節(jié)。”Ideguchi解釋道，由于第一次測量中存在較大的相位對象，受動態(tài)范圍的限制，無法對較小的相位對象進(jìn)行可視化，研究人員稱之為“洗掉”。他們需要第二次測量觀察動態(tài)范圍移位的小相位物體的細(xì)節(jié)。
此外，該方法不需要特殊的激光、顯微鏡或圖像傳感器，研究人員可以使用活細(xì)胞，而且不需要任何染色或熒光，出現(xiàn)光毒性的可能性很小。光毒性是指用光殺死細(xì)胞，這也是其他成像技術(shù)如熒光成像面臨的一個問題。
另一篇論文的通訊作者、日本德島大學(xué)Post-LED光子學(xué)研究所教授Takeshi Yasui指出，在傳統(tǒng)的激光掃描共焦顯微鏡中，強(qiáng)激發(fā)光聚焦在一個焦點(diǎn)上，并對焦點(diǎn)進(jìn)行二維機(jī)械掃描，使光毒性的影響較強(qiáng)。 Yasui等人的熒光成像新方法中，激發(fā)光被聚焦為一個二維焦點(diǎn)，因此每個焦點(diǎn)的光強(qiáng)度變得非常弱。“光毒性高度依賴于入射光的強(qiáng)度，我們的方法也可以顯著降低。”
改造熒光成像
實(shí)際上，熒光顯微鏡廣泛用于生物化學(xué)和生命科學(xué)，因?yàn)樗试S科學(xué)家直接觀察細(xì)胞及其內(nèi)部和周圍的某些化合物。熒光分子能吸收特定波長范圍內(nèi)的光，然后在較長的波長范圍內(nèi)重新發(fā)射。
然而，傳統(tǒng)熒光顯微技術(shù)的主要局限性是其結(jié)果難以定量評價，而且熒光強(qiáng)度受實(shí)驗(yàn)條件和熒光物質(zhì)濃度的顯著影響?，F(xiàn)在，一項(xiàng)新研究將徹底改變熒光顯微鏡領(lǐng)域。
當(dāng)熒光物質(zhì)被一束短脈沖光照射時，產(chǎn)生的熒光不會立即消失，而是隨著時間的推移“衰減”。但熒光衰減非常快，普通相機(jī)無法捕捉到它。雖然可以使用單點(diǎn)光電探測器，但必須在整個樣本區(qū)域進(jìn)行掃描，才能從每個測量點(diǎn)重建出完整的二維圖像。這個過程涉及到機(jī)械部件的運(yùn)動，這極大限制了圖像捕捉的速度。
幸運(yùn)的是，在近發(fā)表于《科學(xué)進(jìn)展》的一項(xiàng)研究中，科學(xué)家開發(fā)了一種不需要機(jī)械掃描就能獲得熒光壽命圖像的新方法。領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)研究的日本德島大學(xué)Post-LED光子學(xué)研究所教授Takeshi Yasui說，“我們能在2D空間上同時映射44400個‘光秒表’來測量熒光壽命——所有這些都在一次拍攝中，不需要掃描。”
“到目前為止，光頻率梳被廣泛地用作測量光頻率的標(biāo)尺，但我們一直在考慮其他的用途。”Yasui在接受《中國科學(xué)報》采訪時說，“我們意識到，如果將光學(xué)頻率梳視為具有超離散多光譜結(jié)構(gòu)的光，通過維數(shù)轉(zhuǎn)換將被測物理量疊加在光譜上，可以從雙梳光譜獲得的模式分辨光譜中共同獲得被測物理量。”
研究人員使用光學(xué)頻率梳作為樣品的激發(fā)光。一個光學(xué)頻率梳本質(zhì)上是一個光信號，它們之間的間隔是恒定的。研究人員將一對激發(fā)頻率梳信號分解為具有不同強(qiáng)度調(diào)制頻率的單個光拍信號(雙梳光拍)，每個光拍攜帶單個調(diào)制頻率，輻照到目標(biāo)樣品上。而且，每束光束都在一個不同的空間位置擊中樣本，在樣本二維表面的每個點(diǎn)和雙梳光拍的每個調(diào)制頻率之間形成一一對應(yīng)的關(guān)系。
研究人員用數(shù)學(xué)方法將測量信號轉(zhuǎn)換為頻域信號，根據(jù)調(diào)制頻率處的激發(fā)信號與測量信號之間存在的相位延遲，計(jì)算出每個像素處的熒光壽命。
Yasui表示，這將有助于動態(tài)觀察活細(xì)胞，還可以用于多個樣本的同時成像和抗原檢測——這種方法已經(jīng)被用于新冠肺炎的診斷。該技術(shù)還有助于開發(fā)出新的頑固性疾病療法，提高預(yù)期壽命。
同樣，Ideguchi也提到，ADRIFT-QPI能夠在整個活細(xì)胞的背景下看到微小顆粒，而不需要任何標(biāo)簽或染色。“該技術(shù)可以檢測到來自納米級粒子的細(xì)小信號，比如病毒或在細(xì)胞內(nèi)外移動的粒子，這樣就可以同時觀察它們的行為和細(xì)胞的狀態(tài)。”
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