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再擴增scFv基因文庫以添加限制性位點進行克隆

2012-12-29  閱讀(1130)

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[方法]
1.在0.5ml微量離心管中,配制兩個50/z1PCR反應混合液(1個用于VH—VκscFv文庫, 另1個用于Vu—Vλ scFv文庫),其中含有:
● 水,36.5//1
● 10XTag緩沖液,5.0ul
● 20XdNTP, 2.5ul
● 正向引物,2.0ul
● 反向引物,2.0ul
● scFv基因文庫(約long), 1.0ul
2.在熱循環儀格內加熱反應管到94℃,5分鐘。如果沒有加熱蓋,則滴加1滴輕質礦物油覆蓋反應液。
3.加入1.0ul(5單位)TdQDNA聚合酶。
4.以94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘的條件共循環25次,擴增scFv基因。
5.用Wizard PCR純化試劑盒,純化PCR產物。

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