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用scFv接頭PCR裝配VH和VL進行scFv基因文庫的構建

2012-12-29  閱讀(1653)

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[方法]
1.在0.5ml微量離心管內配制以下PCR反應混合液。配制成2個“反應管”,1個含有 V。文庫DNA,另1個則含有Vl文庫DNA。
反應管 對照1 對照2
● scFV接頭DNA(100ng/ul) 1.0ul 1.0ul
● VH文庫DNA(100ng/ul) 3.5ul 1.0ul
● V-文庫DNA(Vκ或Vλ)(100ng/ul) 3.0ul 1.0ul
● 水 6.5ul 5.5ul
2.在每管中加入:
● 水,33ul
● 10×Vent緩沖液,5.0ul
● 20×dNTP, 2.5ul
3.在熱循環儀格內加熱反應管到94℃,5分鐘。如果沒有加熱蓋,則滴加1滴輕質礦物油覆蓋反應液(Sigma)。
4.加入2.Ogl Vent DNA聚合酶。
5.以94℃1分鐘、65℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環7次,隨機地連接片段。
6.7次循環后,保持94℃;每套旁側引物各加入lul(等物質的量的6種VHBACK引物的混合物、等物質的量的5種JκFOR或JλFOR引物的混合物,使每種引物混合液zui終總濃度達到10pmol/ul)。
7.以94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘,共25個循環擴增片段。
8.取3ul PCR反應物, 以確定剪接是否成功。已裝配好的scFv長度應為0.8~0.9kb,而且在陰性對照反應中沒有相同大小的產物。
9.用1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化已裝配好的基因文庫,再用Geneclean提取。將每種產物重懸于20ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標準對照品比較,測定DNA濃度。為構建抗體文庫,已剪接的scFv基因文庫接著必須進行再擴增,添加上限制性位點以便能克隆到噬菌粒載體中。

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