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關于細胞劃痕法的詳細介紹

閱讀:1174      發布時間:2024-3-25
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細胞劃痕(wound healing)法是簡捷測定細胞遷移運動和修復能力的方法。
一、原理
在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續培養細胞至實驗設定的時間,取出細胞培養板,在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細胞的生長遷移能力。
通過不同分組之間的細胞對于劃痕區修復能力的不同,可以判斷各組細胞的遷移與修復能力的差別。
二、步驟
1、準備:
所有能滅菌的器械都要滅菌,直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min(超凈臺內)
2、流程:
1. 培養板劃線:先用 marker 筆在 6 孔板背后,用直尺比著,均勻得劃橫線,大約每隔 0.5~1 cm 一道,橫穿過孔,每孔至少穿過 5 條線;
2. 鋪細胞:在孔中加入約 5×105 個細胞,具體數量因細胞不同而不同,掌握為過夜能鋪滿;
3. 細胞劃線:第二天用槍頭比著直尺,盡量垂至于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜;
4. 洗細胞:用 PBS 洗細胞 3 次,去除劃下的細胞,加入無血清培養基;
5. 細胞培養及觀察:放入 37℃、5% 二氧化碳培養箱,培養;按 0,6,12,24 小時取樣,倒置顯微鏡觀察特定位置細胞遷移情況并拍照;
6. 結果分析:使用 Image J 軟件打開圖片后,隨機劃取 6-8 條水平線,計算細胞間距離的均值。
三、注意事項
1、鋪細胞最好使用 6 孔板,因為 6 孔板可以保證有相當距離的平直劃痕,而且因為有 5 條定位線,與劃痕相交,這樣就有10 個可固定監測點,不作重復,誤差也很小。
2、如果你連續監測 24 小時,你需要考慮到劃痕縮小是細胞遷移和細胞繁殖共同作用的結果,而不是單純的細胞遷移。
如果你要單純的考慮細胞遷移,你可以先用(1 ug/ml)處理一小時,抑制細胞的分裂,這樣你的結果就是細胞遷移的作用了。另外,使用無血清培養基也可以降低增殖對實驗結果的影響。
3、照片拍完之后,可以用 ImageJ 來測量劃痕區域的像素定量比較細胞遷移的速度。
4、雖然無血清培養可以忽略細胞增殖的影響,但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節,細胞遷移的速度也會慢很多。
5、應盡量清洗掉散落的細胞,對于一些細胞,低血清濃度下也能重新貼壁并增殖,此外也影響數據美觀。
四、常見問題
1.劃痕法測量適用的細胞范圍較小,一般只適用于上皮細胞,纖維樣細胞。
2.雖然無血清培養可以忽略細胞增殖的影響,但是由于細胞內信號傳導系統整體性的下調節,細胞遷移的速度也會慢很多。
3、在用 PBS 緩沖液沖洗時,注意貼壁慢慢加入,以免沖散單層貼壁細胞,影響實驗拍照結果。
4、一般做劃痕實驗,需要排除細胞增殖的影響,一般在不影響細胞增殖的情況下采用低血清(<2%)或者無血清,否則細胞增殖就不能忽略,這樣對于遷移較慢的細胞就需要延長拍攝時間(也可用絲裂酶處理一小時)。
5、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕,可以形成若干交叉點,作為固定的檢測點,以解決了前后觀察時位置不固定的問題。
6、每次拍照前、后,盡量換掉培養基,去除飄落的細胞,能得到較為干凈的劃痕區域。

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