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在完成試劑配制和樣本預處理后，需特別注意以下操作細節以確保檢測準確性：
1. 加樣標準化
使用多通道移液器時，建議提前校準移液頭精度，每孔加樣量誤差需控制在±2%以內。對于高黏度貝類組織勻漿，建議采用反向吸液法，并在加樣前用預冷PBS潤洗槍頭3次，避免樣本掛壁導致的體積偏差。
2. 溫育環境控制
37℃孵育階段應使用具有主動循環功能的恒溫箱，并在反應板表面覆蓋密封膜時預留5mm透氣邊縫，防止冷凝水積聚。每30分鐘人工搖板1次（振幅10cm，頻率60次/分鐘），可顯著提高抗原抗體結合效率。
3. 洗板關鍵參數
自動洗板機建議設置"預洗-浸泡-終洗"三步程序：預洗液量300μL/孔（流速1mL/s），Tris緩沖液浸泡60秒，終洗采用脈沖式沖洗（5次×200μL/次）。手工洗板時需保持洗液注滿板孔后靜置90秒，棄液時板體傾斜45°角輕叩10次。
?4. 顯色終止時機
當標準品最高濃度孔OD值達到0.8-1.2時（波長450nm），應立即終止反應。對于富含黑色素的貽貝樣本，建議在終止后30分鐘內完成讀數，并使用620nm參比波長校正濁度干擾。
5. 數據質控要點
每批次應包含3個質控樣本：空白對照（零標準品）、基質加標回收樣（80-120%回收率）、重復樣（CV值<8%）。當標準曲線R2值<0.99時，需復核標準品梯度稀釋步驟是否出現跳管污染。
特殊情況下（如檢測扇貝生殖腺樣本），可適當調整樣本稀釋倍數至1:5，并延長封閉時間至45分鐘。所有操作需在避光環境下完成，避免5-HT光降解。實驗結束后，剩余96孔板條應立即裝入含干燥劑的鋁箔袋，4℃保存不超過72小時。
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