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上海淳麥生物科技有限公司

EHA101農桿菌感受態細胞

時間:2019-6-23閱讀:984
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EHA101農桿菌感受態細胞

EHA101 Chemically Competent Cell

產品編碼:                        保存條件: -80℃   
產品規格:

EHA10120×100 μl
pK7WGF2 (control vector)10 ng/μl            10 μl

                
EHA101農桿菌感受態細胞基因型:
C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline
EHA101農桿菌感受態細胞簡要說明:
 EHA101菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)
pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) Ti質粒含有篩選標簽:strepkan,賦予EHA101菌株鏈霉素抗性和卡那霉素抗性,適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作,經pK7WGF2質粒檢測轉化效率可達10cfu/μg DNA

EHA101農桿菌感受態細胞操作說明:

  1.  -80℃保存的農桿菌感受態于冰上待其部分融化,處于冰水混合狀態時插入冰中。
  2.  100 μl  感受態加1 μg(體積不大于10 μl)質粒DNA,用手管底混勻,依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。
  3.  加入700 μl無抗生素的LBYEB液體培養基,于28℃,200rpm振蕩培養2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LBYEB平板上,倒置放于28℃培養箱培養2-3天。
EHA101農桿菌感受態細胞注意事項:

  1.  加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10;質粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉化效率急劇下降;質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。
  2.  混入質粒時應輕柔操作,轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。
  3.  利福平濃度不應高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農桿菌生長,會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板同時含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2

4. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌;根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失,但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作,所以一般培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti質粒丟失的概率極低 (可以忽略)

上海淳麥生物科技有限公司  感受態細胞培養專家  4006815880

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