葡萄糖脫氫酶（Glucose dehydrogenase，GCDH）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

葡萄糖脫氫酶試劑盒 糖代謝

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高等動物的肝臟和弱氧化醋桿菌中。在低聚果糖生產中使用GCDH，不僅能去除低聚果糖中的葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸與鈣離子結合生成的葡萄tang酸鈣是一種理想的補鈣制劑。因而，GCDH已成為制備高含量低聚果糖的理想用酶。

測定原理：

GCDH 催化D-葡萄糖和NAD 生成D-葡萄糖酸和NADH，在 340nm 下測定NADH 上升速率，即可反映GCDH 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織的前處理：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

細菌或培養細胞的前處理：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零；

2、工作液的配制：臨用前將試劑二轉移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃可保存一周；

3、將工作液置于 37℃預熱 5 分鐘。

4、在 1ml 石英比色皿中加入 10μl 樣本和 190μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

GCDH 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下：

按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=6430×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GCDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.05cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

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