異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

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正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發過程中，通過乙醛酸循環及其他過程將脂肪轉變成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循環的關鍵酶之一。

測定原理：

ICL 催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在LDH 的作用下生成乙醇和NAD，NADH在 340nm 下有特征吸收峰，監測 340nm 吸光度的減小速率可間接反應ICL 活性。

試劑組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細菌或培養細胞：

先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：

按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

工作液的配置，將試劑二和試劑三轉移至試劑一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

在試劑四中加入 4ml 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、150μl 工作液和 40μl 試劑四，混勻，立即記錄340nm 處 20s 時的吸光值A1 和 2min20s 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

ICL 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=3216×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=6.25×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

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