考馬斯亮藍染色測定蛋白質含量
一、實驗原理
考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）測定蛋白含量存在著兩種不同顏色形式，紅色和藍色。此染料與蛋白質結合后顏色由紅色形式轉變藍色形式，zui大光吸收由465nm變成595nm。在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律（Beer’s law），因此可以通過測定染料在595nm處吸收的增加量得到與其結合的蛋白質量。本法測定范圍為10~100µg蛋白質。
由于該法簡單、迅速、干擾物質少、重復性好、靈敏度高，現已廣泛應用于蛋白質含量測定。
二、實驗用品
(一)器材
(1) 722分光光度計。
(2) 微量進樣器。
(3) 移液管（0.1ml及5ml）。
(4) 試管及試管架。
(二 )、試劑
(1)標準蛋白質溶液：結晶牛血清白蛋白，預先經微量凱氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6測定蛋白質含量，再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白質溶液。
(2)考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。zui終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。
(三)材料
末知蛋白質溶液，要求蛋白質濃度范圍為0.1~5mg/ml，若濃度過度時，需用0.15mol/LNaCl溶液適當稀釋。
三、實驗程序
（一）操作方法
1.標準法制作標準曲線
取14支試管，分兩組按表1-1平行操作。
以OD595為縱坐標,標準蛋白為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
2.微量法制作標準曲線
取12支試管，分兩組按表1-2平行操作。
3.末知樣品蛋白質濃度的測定
測定方法同上，取合適的末知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內，根據所測定的OD595值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出末知樣品的蛋白質濃度（mg/ml）。
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