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上海遠慕生物科技有限公司
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質粒提不出和得率較低的原因分析2023/11/16
質粒提不出和得率較低的原因1)大腸桿菌老化:請涂布平板培養后,重新挑選新菌落進行液體培養。2)質粒拷貝數低:由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數載體。3)菌體中無質粒:有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在,經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如,柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定,因此,不要頻繁轉接,每次接種時應接種單菌落,另外,檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。4)堿裂解不充分:使用過多菌體培養液,會導致菌體裂解不充分。5)吸附柱過載:不同產品中吸附柱吸附能
大腸桿菌質粒DNA的提取步驟2023/11/16
質粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術,但提取方法有很多種,以下介紹一種最chang用的方法:堿裂解法:此方法適用于小量質粒DNA的提取,提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下:1、接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2mlLB培養基。2、37℃振蕩培養過夜。3、取1.5ml菌體于Ep管,以4000rpm離心3min,棄上清液。4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合。5、加入0.2m
如何用細菌培養皿來檢測細菌?2023/11/15
怎么用培養皿培養細菌1.將培養皿清洗干凈,用牛皮紙或紗布包裹后,于高壓滅菌器中121℃30分鐘滅菌待用。2.將樣品用無菌生理鹽水溶解,將稀釋液1ml注入培養皿中,倒入已經滅菌好的培養基,待凝固。3.將培養皿置36℃生化培養箱中培養2~3天,觀察培養基中生長的菌落。細菌和真菌的分布作為自然界中微生物的細菌和真菌是我們肉眼看不見的,必須借助于一定的器械(顯微鏡),但是它們又是無處不在的。未了弄清楚它們的分布情況,特進行探究:1、實驗中要選取五套培養皿進行實驗,一個做為對比,另外四個用來培養不同環境中
液體培養基中細菌培養實驗步驟2023/11/15
實驗步驟一、過夜培養1.將5ml預熱的液體培養基移入一無菌的16mm或18mm管中。2.用接種環挑一個單菌落,浸沒于培養液中并輕輕振動接種環,使待接種的細菌分散在培養液中。3.蓋好試管,在搖床或轉鼓式培養裝置上以60r/min速度,于37°C培養至飽和(1X109~2X109細胞/ml,6h)。二、大體積培養1.在一無菌的Erlenmeyer或baffle瓶中,用新鮮預熱的培養液按I1:100的比例稀釋過夜培養物,燒瓶的體積應該是培養液體積的5倍以上。如果不搖動培養,所用燒瓶的體積應比培養液體積
沙門氏菌檢驗中血清學試驗常見問題解答2023/11/14
沙門氏菌的理化性質:生化反應很活潑,能分解多種糖類和醇。培養特性1)需氧及兼性厭氧菌。2)在普通瓊脂培養基上生長良好,培養24h后,形成中等大小、圓形、表面光滑、無色半透明、邊緣整齊的菌落,其菌落特征亦與大腸桿菌相似(無糞臭味)。3)鑒別培養基(麥康凱、SS、伊紅美藍):一般無色菌落。4)三糖鐵瓊脂斜面:斜面為紅色,底部變黑并產氣。生化特性1)發酵葡萄糖,麥芽糖,甘露醇和山梨醇產氣;2)不發酵乳糖、蔗糖和側金盞花醇;3)不產吲哚、V-P反應陰性;4)不水解尿素和對苯丙氨酸不脫氨。傷寒沙門氏菌、雞
蛋白質糖基化位點檢測實驗步驟2023/11/14
蛋白質糖基化位點檢測:用酶或化學脫糖基化、通過選擇性標記或通過凝集素親和層析法是檢測蛋白糖基化常用方法。一、用PNGaseF(N-多糖酶)處理。1.以0.1mol/L磷酸鈉(或Tris-HCl,而不用檸檬酸)緩沖液,pH7.4(7.0~8.0)配制高達2mg/ml的蛋白溶液,并含50mmol/Lβ-巰基乙醇和0.1%SDS,在水浴中煮沸2分鐘。2.加1/10體積的10%NP-40溶液(或使SDS濃度少于或等于0.17%,NP-40:SDS的質量比在終反應中至少是7:1)。3.加PNGaseF到終
淺談一下動物細胞培養的原理2023/11/13
動物細胞培養是指細胞在體外條件下的生長,動物細胞在培養的過程中不再形成組織。從動物機體中取出相關的組織,將它分散成單個細胞,然后放在適宜的培養基中,讓這些細胞生長和增殖。用途指動物、(包括哺乳動物、昆蟲、魚類、禽類等)細胞在體外的培養技術,即在無菌條件下,從機體中取出組織或細胞,模擬體內正常生理狀態下生存的基本條件,讓它在培養器皿中繼續生存、生長和繁殖的方法。體外培養的細胞可分為原代細胞和傳代細胞。動物細胞培養給細胞生物學的研究帶來了極大的方便,解決了以人的活細胞材料作為研究對象或研究工具的問題
PH測量一定要標定校準嗎?2023/11/13
pH測量通常有比色法(pH試紙或比色皿)和電極法二種。比色法當然不要標定,而電極法就一定要標定,因為電極法pH測量就是將未知溶液與已知pHs值的標準溶液在測量電池中作用比較測定,這是電極法pH測量的“操作定義”所決定的。pH計因電計設計的不同而類型很多,其操作步驟各有不同,因而pH計的操作應嚴格按照其使用說明書正確進行。在具體操作中,校準是pH計使用操作中的一重要步驟。盡管pH計種類很多,但其校準方法均采用兩點校準法,即選擇兩種標準緩沖液:一種是pH7標準緩沖液,第二種是pH9標準緩沖液或pH4
PCR基因擴增原理和基本程序2023/11/10
基因擴增技術(PCR)聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction簡稱PCR)又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法,是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍,從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力,能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品,因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。由于PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點,已在病原微生物學領域中顯示出巨大的
標準物質常見種類簡單介紹2023/11/10
標準物質RM(referencematerial)是具有準確量值的測量標準,是具有一種或多種足夠均勻并已確定特性值的,用于校準設備、評價測量方法或給材料賦值的材料或物質。應用于化學測量、生物測量、工程測量、無力測量等領域。有證標準物質CRM(certifiedreferencematerial)是附有證書的標準物質,用建立了溯源性的程序來確定其一種或多種特性值,使之可溯源到準確復現的用于表示該特性值的計量單位,而且每個標準值都附有給定置信水平的不確定度。其證書是介紹標準物質的技術文件,是研制者/
纖維蛋白vs纖維蛋白原,一字之差的區別2023/11/09
1、定義纖維蛋白:是人類發現最早的一種凝血因子,呈伸長的橢球體,是由三對多肽鏈(一對α鏈、一對β鏈、一對γ鏈)以二硫鍵連接而成的二聚物,在肝臟中合成后進入血漿,以溶解形式存在。纖維蛋白原:是一種蛋白質,能夠溶解于水,是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質,是凝血過程、血栓形成過程中的重要物質。2、來源纖維蛋白:是一種高度不溶的蛋白質多聚體,是象細針一樣的晶狀物。是纖維蛋白原在生理條件下凝固而成的一種材料。纖維蛋白原:是在凝血過程中,凝血酶切除血纖蛋白原中的血纖肽A和B而生成的單體蛋白質。3、成因
培養基與培養皿滅菌方法介紹2023/11/09
為了避免雜菌污染,獲得微生物純培養物,培養基必須及時嚴格滅菌。通常采用高壓蒸汽滅菌。一般培養基用0.IMPa(121℃)維持15~30min即可徹di滅菌。長時間的高溫滅菌會使某些不耐熱的物質破壞,如使糖類物質形成氨基糖、焦糖。因此,含糖培養基常用0.05MPa(110℃)滅菌20~30min某些對糖類要求更高的培養基,可先將糖過濾除菌或間歇滅菌,再與其他已滅菌的成分混合。長時間高溫滅菌也會使磷酸鹽、碳酸鹽與鈣、鎂鐵等陽離子形成難溶性化合物而產生沉淀。為了防止這類沉淀發生,可將這些物質分別滅菌,
DNA和RNA提取原理都在這里了!2023/11/08
TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質.TRIzol使樣品勻漿化,細胞裂解,溶解細胞內含物,同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入lv仿離心后,溶液分為水相和有機相,RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中間層可回收DNA;用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質。TRIzol試劑可用于小量樣品(50-100mg組織、5×106細胞)也適用于大量樣品(
組織RNA提取和培養細胞RNA提取總結2023/11/08
一.組織RNA提取1.最好新鮮組織,這樣RNA提取的效果比較好,這是肯定的。2.如果不是新鮮的(最好在半年之內,-80℃或者液氮中凍存的)組織,注意不要反復凍融,從冰凍狀態拿到0-4℃,注意不要拿到常溫,待組織解凍后,用DEPC泡過的剪刀剪一小塊組織,稱重后,放到預冷的勻漿器中,然后加入一定量的TRIZOL試劑,然后勻漿。注意:速度不要太快,要勻一會挺一會,否則由于摩擦產熱,RNA遇熱會加速降解。如果一次做多個標本的RNA提取,也要這樣做,更不能急。后面的步驟和細胞RNA提取一樣。二.培養細胞的
常用的分子生物學技術簡單介紹2023/11/07
分子生物學是指在分子水平上研究生命現象的科學,從生物大分子(核酸、蛋白質)的結構、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現象的本質。研究內容包括各種生命過程,如光合作用、發育的分子機制、神經活動的機理、癌的發生等。生物大分子,特別是蛋白質和核酸結構功能的研究,是分子生物學的基礎。分子生物學技術:PCR、分子克隆、核酸電泳、瓊脂糖凝膠電泳測序、DNA,RNA提取、轉化外源DNA、體外轉錄、逆轉錄、cDNA文庫構建、原位雜交、酵母雙雜交、差減雜交、扣除雜交、藍白斑篩選、抗生素篩選、基因工程技術大部分都是
高純試劑用途盒純度表示介紹2023/11/07
高純試劑簡介高純試劑是反映化學試劑純度高低的一個類別概念,它表示,該試劑中起干擾作用離子的相對量很少;該試劑可以被用于一般的定量分析實驗。比如,色譜用的乙腈,是一種高純試劑。用途高純試劑通常應用于,例如針對色譜使用的色譜純試劑、針對光譜使用的光譜純試劑。此外,電路、液晶等領域都有各自行業標準的高純試劑。但是高純試劑通常不使用在分析純試劑使用的領域,如配制標準溶液、滴定劑等,高純的單質例外。純度表示不同行業使用的高純試劑有各自的標注方式,通用的標注是用9的數目來表示。例如,純度為99.999%,含
細胞中的DNA合成途徑分析2023/11/06
細胞中的DNA合成有兩條途徑:一條途徑是生物合成途徑(“D途徑”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中,葉酸作為重要的輔酶參與這一過程,而HAT培養液中氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗物,可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一條途徑是應急途徑或補救途徑(“S途徑”),它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸,兩種酶缺一不可。因此,在HAT培養液中,未融合的效應B細胞和兩個效應B細
組蛋白的分類及功能簡單介紹2023/11/06
組蛋白是構成真核生物染色體的基本結構蛋白,富含帶正電荷的Arg和Lys等堿性氨基酸,等電點一般在pH10.0以上,屬堿性蛋白質,可以和酸性的DNA緊密結合,而且一般不要求特殊的核苷酸序列。用聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區分5種不同的組蛋白:H1、H2A、H2B、H3和H4。幾乎所有真核細胞都含有這5種組蛋白,而且含量豐富,每個細胞每種類型的組蛋白約6×10個分子。5種組蛋白在功能上分為兩組:①核小體組蛋白。包括H2A、H2B、H3和H4。這4種組蛋白有相互作用形成復合體的趨勢,它們通過C端的疏水氨基酸
細胞融合實驗看這篇就夠了2023/11/03
細胞融合(cellfusion),細胞遺傳學名詞,是在自發或人工誘導下,兩個細胞或原生質體融合形成一個雜za種細胞。基本過程包括細胞融合形成異核體(heterokaryon)、異核體通過細胞有絲分裂進行核融合、最終形成單核的雜za種細胞。細胞融合可作為一種實驗方法被廣泛適用于單克隆抗體的制備,膜蛋白的研究。細胞融合實驗所需試劑:(1)胎牛血清或小牛血清(2)培養基:細胞融合常用的培養液有DMEM、RPMI1640及無血清培養基等。DMEM有高糖(4500mg/L)及低糖(1000mg/L)之分。
冰凍切片免疫熒光實驗步驟2023/11/03
冰凍切片免疫熒光實驗步驟1、冰凍切片固定冰凍切片37℃烘烤10至20分鐘,控干水分,置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS緩沖液中晃動洗滌3次,每次5分鐘。2、抗原修復將切片浸沒在升滿EDTA抗原修復緩沖液(PH8.0)的修復盆中,置于微波爐內進行抗原修復,修復條件:中火8min至沸——停火8min保溫——中低火7min(整個過程需防止修復液過度蒸發,切勿干片。自然冷卻后,將切片置于PBS緩沖液中。然后在搖床上,晃動洗滌3次,每次5min。3、畫圈血清封閉切片稍甩干后,用組化筆在組織周圍畫圈,
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