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多能ES細胞的培養(yǎng)2022/12/01

材料與儀器PBS胰酶溶液MEF滋養(yǎng)板巴斯德吸管ES生長培養(yǎng)基步驟1.準備下列試劑和材料：60mmMEF滋養(yǎng)板（接種不能超過7天）帶棉塞無菌巴斯德吸管無Ca2+和Mg2+PBSES生長培養(yǎng)基胰酶溶液2.PBS沖洗ES細胞，巴斯德吸管加胰酶溶液覆蓋培養(yǎng)皿底（2ml/p60）3.37℃孵育5分鐘左右，至細胞脫落。4.巴斯德吸管輕輕吹吸胰酶處理細胞4~6次，分散ES細胞。分散的細胞，包括單細胞和小的細胞團，轉移至裝有2ml預熱（37℃）ES生長培養(yǎng)基的15ml離心管。5.離心收集細胞。吸掉上清，留約兩倍

DAPI染DNA的原理及使用方法2022/12/01

材料與儀器DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式為C16H15N5·2C3H6O3，分子量457.48。DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料。它結合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對處，一個DAPI分子可以占據(jù)三個堿基對的位置。結合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強度提高大約20倍，常用與熒光顯微鏡觀測，根據(jù)熒光的強度可以確定DNA的量。另外，因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。在熒光顯微鏡

測定蛋白含量都有哪些方法？2022/11/01

蛋白的含量的測定方法主要有紫外分光光度法、Lowry法、BCA法等。紫外分光光度法原理蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)在275~280mm有一紫外吸收峰。在一定濃度范圍內，其在280mm的吸光度與蛋白濃度成正比。方法取適量蛋白溶液（約3.5ml），置于光徑為1cm的石英比色杯、用與溶解蛋白的緩沖液相同的緩沖液為對照，在280mm波長處測定吸光度，吸光度為1.0的蛋白溶液，蛋白濃度約為1.0mg/ml。當溶液中含少量核酸時，應同時測定260nm波長處的吸光度，以下式估算蛋白濃度：蛋白濃度（mg/

怎樣辨別是否細胞污染？2022/11/01

培養(yǎng)細胞最擔心的就是細胞污染，這期繼續(xù)分享如何辨別細胞污染的經(jīng)驗。★識別支原體污染這是一種很難發(fā)現(xiàn)卻經(jīng)常存在的問題。支原體是最小的（0.3μm）能夠自我復制的有機體，倒置顯微鏡下通常觀察不到。支原體沒有細胞壁，對常用的抗生素不敏感。支原體感染是極為不易察覺的，可能直到出現(xiàn)了可以觀察到的病變或發(fā)現(xiàn)細胞正常功能喪失的時候，才意識到是發(fā)生了支原體感染。在沒有采用特殊的染色方法，也沒有觀察到病變的情況下，實驗總是不成功，就應懷疑被支原體污染。預防支原體污染的惟-途徑是經(jīng)常對細胞進行篩選。★防止支原體感染

如何才能把細胞培養(yǎng)好？2022/11/01

一、細胞培養(yǎng)的基本概念（1）基本概念細胞培養(yǎng)：狹義的細胞培養(yǎng)主要是指分離（散）細胞培養(yǎng)，廣義的細胞培養(yǎng)還包括單（個）細胞培養(yǎng)又稱克隆（clone），是指單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。原代培養(yǎng)：即第一次培養(yǎng)，指將培養(yǎng)物放在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。傳代：原代培養(yǎng)成功后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面因營養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于生長或發(fā)生中毒。需要將

細胞污染如何識別？2022/11/01

在培養(yǎng)細胞過程中，同學們最擔心的就是細胞污染。因此，今天給大家分享如何辨別細胞污染的經(jīng)驗，趕快學起來吧~一、肉眼觀察把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來，對者光線檢查●渾濁情況：即使細胞密度很高，培養(yǎng)基也應該是透明的。輕輕移動或晃動培養(yǎng)瓶，觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況，一些霉菌可能會在培養(yǎng)基的表面形成菌落。●培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下，加了酚紅的培養(yǎng)基會由紅變黃，而堿性條件下會變成紅紫色。細菌污染常常會使培養(yǎng)基變成黃色，真菌污染會使培養(yǎng)基變成深紫紅色。注意：丟掉細胞以前要仔細檢查一下，快速生長和生長過量的細胞

Western Blot結果不理想怎么辦？2022/11/01

1簡述WesternBlot（簡稱WB），蛋白質免疫印跡法，是基于蛋白質SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過顯色技術，以達到檢測目的蛋白的技術。該技術廣泛應用于定性檢測蛋白水平的表達，活性分析與鑒定。該實驗步驟多，關鍵點多，耗時長，每個步驟可能都影響最終的結果，所以實驗中經(jīng)常出現(xiàn)各種問題。本文對WB實驗中常出現(xiàn)的各種問題進行歸納總結，并給出相應的解決方法，以便了解WB實驗中的注意點和規(guī)范操作的必要性，同時對WB出現(xiàn)的問題分析和解決提供參考。2實驗原理WB以組織或細胞中的蛋白質

為什么培養(yǎng)基的顏色會改變？2022/10/28

我們剛剛購買回來的培養(yǎng)基是鮮紅色的，為什么不是綠色、藍色的呢？培養(yǎng)基的顏色主要來自酚紅，酚紅指示顏色非常靈敏，pH值范圍為6-8，顏色由黃變?yōu)樽霞t。為了培養(yǎng)方便，能讓我們直觀地感覺培養(yǎng)液的狀況，加入酚紅后，如果培養(yǎng)液偏酸，就顯示偏黃色，偏堿性則會顯示偏紫色。一般來說，污染細菌或者長時間不換液時，培養(yǎng)基變成黃色，主要是因為細菌和細胞過度增長，產(chǎn)生了酸性物質。開封后的培養(yǎng)基保存在4℃冰箱中，培養(yǎng)基內的二氧化碳會逐漸溢出，pH偏堿性，所以培養(yǎng)基就偏紫色了。偏紫色的培養(yǎng)基，可以通入無菌過濾的二氧化碳，調

看血清的顏色能判斷質量好壞嗎？2022/10/27

你會根據(jù)顏色深淺判斷血清質量好壞嗎？常規(guī)的細胞培養(yǎng)離不開血清，血清來源于動物體內，比例牛、馬、豬等，即使采集技術、純化工藝非常成熟，但因為動物本身存在個體差異，所以血清無法像培養(yǎng)基一樣做到產(chǎn)品質量*的恒定均一。那怎么判斷血清質量的高低呢？有的同學說看顏色，這個方法其實并不可取。血清中顏色偏紅，是由于血清內存比較多的膽紅素，它來源于血紅蛋白，是由于在采集血清時，被采集動物出現(xiàn)了較嚴重的溶血現(xiàn)象時，膽紅素才會大量存在于血清中，它與采集工藝的成熟度有關，與血清自身的質量并沒有太大關系。而要判斷血清的質

貼壁細胞培養(yǎng)如何選擇培養(yǎng)器皿？2022/10/27

塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿......你知道應該怎么選擇嗎？這里介紹常見的幾種培養(yǎng)器皿，有什么樣的特點，給各位同學參考。多孔板，適合進行多次微量細胞的重復實驗，有蓋子，需要封口膜將蓋子邊緣密封，減少蒸發(fā)。對于單層培養(yǎng)物來說，細胞的產(chǎn)量和有效表面積成正相關，其他影響則是營養(yǎng)物濃度、氧含量等因素。所以，多孔板培養(yǎng)的微量細胞，不適合日常使用，需要轉換到培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿。培養(yǎng)瓶，由平面、淺層斜肩、襯墊和深螺旋瓶蓋組成。平面供細胞貼壁生長，斜肩可幫助收集消化細胞，深螺旋瓶蓋和襯墊提高培養(yǎng)瓶的密封性。型號如T

培養(yǎng)細胞時，如何確認需要多少血清呢？2022/10/27

配制完培時，是按10%加入血清還是15%、或甚至20%？加多了，經(jīng)費在燃燒，加少了，細胞長不不好。如何優(yōu)化出最合適的血清濃度？我們可以通過觀察幾個參數(shù)來判斷，其中一個叫貼壁效率。具體做法是：將細胞以一個非常低的密度接種于多個培養(yǎng)瓶，例如1000個/瓶，然后使用含不同濃度血清的完培分別培養(yǎng)這幾瓶細胞，例如5%、10%、15%和20%。培養(yǎng)10-14天后觀察，并計算培養(yǎng)瓶內有多少個細胞集落（約50個細胞堆在一起算一個集落）。如果兩瓶細胞的集落數(shù)量接近，則低濃度的血清是更優(yōu)的選擇。對于細胞培養(yǎng)而言，胎

培養(yǎng)基中加入雙抗細胞就可以避免被微生物污染了？？2022/10/27

配制完培時，會根據(jù)情況加入很多添加物，其中就有雙抗。雙抗是指青霉素和鏈霉素按一定比例混合的抗生素溶液，它對微生物生長具有一定的抑制作用。但不少同學存在一個誤區(qū)，就是加入的雙抗可以殺滅細菌，加入雙抗后，細胞就可以避免被微生物污染。其實并不是，雙抗僅僅能對培養(yǎng)環(huán)境中的微生物繁殖產(chǎn)生一定的抑制作用，它無法深透徹消滅微生物污染，反而因為有雙抗的存在，還增加了微生物污染的隱蔽性和長期風險。因為微生物生長被抑制了，但還是存在，我們無法及時做出有效判斷，會以為并沒有污染，其次，微生物經(jīng)過長期的抗生素壓力篩選，

培養(yǎng)基常溫儲存還是放冰箱？2022/10/27

培養(yǎng)基從原來需要逐個成分配制，到現(xiàn)在可以直接購買不同類型的即用型液體培養(yǎng)基。使用上是越來越方便了，大家收到培養(yǎng)基時，會立即存放冰箱保存嗎？還是室溫放置？收到的常規(guī)培養(yǎng)基，例如1640、dmem、MEM等，如果不打開使用，可以存放于室溫，沒有必要放在冰箱內。因為現(xiàn)在的培養(yǎng)基成分在室溫下都是穩(wěn)定的，即便是容易降解的谷氨酰胺，現(xiàn)在也有了功能相同但穩(wěn)定性高很多的替代物了。但如果已經(jīng)打開，并且加入了添加物，例如血清的話，還是需要放在冰箱儲存。新配制的完培養(yǎng)基，還應該單獨吸取一部分到空白的培養(yǎng)瓶內放置于培養(yǎng)

原代角質形成細胞的分離培養(yǎng)方法2022/10/26

為什么越來越多的生物實驗開始使用原代細胞？原代細胞在相關細胞實驗使用過程中越來越多，人們不再單單趨于使用細胞系進行實驗研究，因為細胞系常常由于體外長期培養(yǎng)，而容易丟失原有的生物學特性，對藥物處理的反應差距越來越大。原代細胞剛從組織中分離開，生物學特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也*為接近和反應體內生長特性，原代細胞的活力和生長狀態(tài)都比較好，細胞的純度和基因保留可達到90%以上，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等試驗研究，使用原代細胞進行實驗，可以獲得更準確的研究和數(shù)據(jù)。角質形成細胞角質

原代小鼠心肌成纖維細胞分離培養(yǎng)方法2022/10/25

小鼠心肌成纖維細胞的組織來源于實驗動物的正常心臟組織，心臟是脊椎動物身體中最重要的一個器官，主要功能是提供壓力，把血液運行至身體各個部分。心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應氧和各種營養(yǎng)物質，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機鹽、尿素和尿酸等），使細胞維持正常的代謝和功能。心臟中，心肌成纖維細胞約占正常心肌組織細胞總數(shù)的60%-70%，是心臟中非心肌細胞的主要組成部分，廣泛存在于心臟組織中，包圍心肌細胞，連接心肌細胞間質，與缺血性心臟病、炎癥、肥大、梗死等病理狀態(tài)密切

實驗過程中不增殖的細胞有哪些？2022/10/25

在生物醫(yī)學實驗中，常常會用到大量的細胞進行實驗，而往往通過各種渠道得來的細胞數(shù)量都有限，無法滿足實驗過程中所需要的細胞數(shù)量，所以為了使實驗更順利的進行，科研人員往往需要前期對所需的細胞進行擴充培養(yǎng)，以便在后期的實驗中，可以不間斷使用。通常的細胞實驗中，很多科研人員都會根據(jù)實驗方案選擇常見的細胞，包括無限傳代的細胞系和有限傳代的原代細胞，一般的細胞都具有分裂增殖的能力，可以進行凍存、復蘇及傳代，因為這樣的難度系數(shù)低，實驗會少出現(xiàn)波折，也有少量的實驗研究會用到一些特殊的細胞。細胞系可無限傳代，但是由

什么是細胞遷移與侵襲？2022/10/25

細胞遷移也叫做細胞爬行，細胞移動或者細胞運動，是細胞在化學信號（如：趨化因子）的驅使下沿著濃度梯度從一個區(qū)域轉移到另一區(qū)域的運動，是活細胞普遍存在的一種運動形式。細胞遷移在損傷修復，細胞分化，胚胎發(fā)育，腫瘤轉移等生理病理過程中普遍存在。細胞侵襲與細胞遷移比較類似，但是“侵襲”需要細胞穿過胞外基質層（ECM）或基底膜基質層（BME），在這個過程中細胞先酶解去除ECM/BME的阻礙，從而在趨化因子濃度梯度的驅使下完成從一處到另一處的移動。常用來評估腫瘤細胞在正常組織中轉移的能力，但正常細胞，如巨噬細

如何做好HE染色？2022/10/25

HE染色是組織切片最為常用的染色法之一。其中，蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核酸表現(xiàn)為藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分呈現(xiàn)紅色。但如何保證自己每一次都能完成漂亮的染色呢？有道是老馬都可以失前蹄兒，為了讓大家對HE染色有著更清晰的認識，小編搜集查詢了下面的內容，希望能對大家的染色技巧有一定的提升。顏色篇（1）染色結果紅藍失調偏藍，蘇木精染色過深或伊紅染色時間太短導致其分化過度；偏紅，細胞核未成功染色，蘇木精染色過淺或伊紅染色過深，脫蠟不透徹也是一個原因。（

細胞培養(yǎng)常遇到的問題解決辦法2022/10/24

養(yǎng)細胞是一件勞心勞力的事。要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護它，呵護它。這次就來講講細胞培養(yǎng)常見問題的原因及解決辦法。1培養(yǎng)液pH值變化太快原因：CO2張力不對培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足培養(yǎng)液中鹽濃度不正確細菌、酵母或真菌污染解決辦法：按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。或者改用不依賴CO2培養(yǎng)液松開瓶蓋1/4圈加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’

實驗新手如何養(yǎng)好細胞？2022/10/24

常聽到一些新手同學養(yǎng)細胞，自己總是經(jīng)歷失望-絕望-希望的過程，現(xiàn)在為了方便一些新手同學養(yǎng)好細胞。把幾點注意問題跟大家分享一下，希望能夠對新手們稍有幫助：1.細胞不要過度消化，有些貼壁不牢的如293T，加入胰酶在臺子里晃晃就可以了，不用放到溫箱中；2.傳代時，細胞分的稀了或者分的不均勻，形成單細胞的克隆群，細胞就會長成密密麻麻的一群，如293T會成為小方塊狀，而不是正常的不規(guī)則形狀，這時候，即使沒有長滿盤，也應該消化重新鋪板。3.貼壁細胞的上清看起來清亮、顏色正常時，即使在鏡下檢測有些懸浮物，一般