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分離原代人角膜間質細胞2022/12/09

原理材料與儀器完整的人角膜CMF-SaIineG中性蛋白酶IIL型膠原酶1mgml在DMEMF-12GASP中CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶DMEMF-12GASPDMEMF-122FBGASP:DMEMF-12GASP含2%FBSCMFGASP3.5cm塑料組織培養皿或6孔板手術刀或單刃的安全刀片細胞濾網70μm血液尼龍過濾網塑料刮片“CellLifter”或“CellScraper”彎虹膜剪11cm(4-38in.)Jeweler’s鑷10cm(4

平滑肌細胞的分離和培養2022/12/09

料與儀器0.25%胰蛋白酶和EDTA混合液平滑肌培養液Petri培養皿手術刀和10號手術刀片解剖剪組織鑷步驟1.從小牛取胸主動脈。2.將胸主動脈浸入Hanks液。3.分離細胞之前將動脈放在冰上。4.將動脈放入150mm×25mmPetri培養皿。5.用解剖剪沿長軸剪開動脈。6.用手術刀片輕刮動脈內腔面，以除去內皮細胞。7.將動脈的中膜與內膜和外膜分離。8.將中膜切成約1cm2大小的組織塊。9.將中膜組織塊放入60mm×15mmPetri培養皿，內膜側朝下。10.讓組織塊貼壁約10min。11.直

昆蟲細胞的擴增2022/12/07

原理用機械法從細胞單層分離細胞，在27°C條件下和懸浮狀態下進行擴增培養。材料與儀器Sf9細胞二甲基亞砜PluronicF68生長培養液培養瓶旋轉培養瓶和磁力攪拌器27°C培養箱步驟常規維持培養1.通過刮取法或用培養液沖洗細胞（(ATCC#CRL-1711)或從甘藍環Trichoplusiani獲得的細胞系（Tn368或BTI-TN-5B1-4，也稱“HighFive”，可從Invitrogen購買））法使細胞從培養瓶中脫落，或者利用在旋轉瓶中懸浮生長的細胞。2.用血細胞計數板計數細胞，通過用臺

結腸直腸腫瘤細胞的培養2022/12/07

原理通常用酶消化腺瘤，用手術刀片將癌組織切碎。如果分化良好的結腸直腸癌標本切開后仍不易分離細胞，可用酶消化方法分離。材料與儀器用于傳代培養的Dispase生長培養液洗液消化液培養瓶步驟一、酶消化1.用洗液（洗液：添加5%FBS、200U/ml青霉素、200ug/ml鏈霉素和50ug/ml慶大霉素。在原代培養時，慶大霉素的作用至少維持一周，然后除去。）清洗腫瘤標本4次。2.將組織塊放入小量洗液中，洗液恰好浸沒組織塊（避免組織干）。用交叉的手術刀片或鋒利手術剪將組織塊剖成約1mm3小塊。3.通過用臺

口腔角質形成細胞2022/12/07

材料與儀器D-PBSA0.17%胰蛋白酶PET轉運培養液生長培養液含抗菌素的生長培養液手術刀和11號刀片眼科剪眼科鑷2把50mm或100mm培養級Petri培養皿35mm和100mm非培養級Petri培養皿15ml錐形離心管微量加液器涂有FNCBSA的50mm培養皿步驟一、原代培養1.取手術切除或早期活檢組織，將組織放入轉運培養液（LeibowitzL-15培養液，添加100μg/ml慶大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和1μg/ml2性霉素B），盡快送到實驗室。2.將組織移入

角膜上皮細胞培養實驗2022/12/07

原理將角膜組織置于膠原蛋白上，使其附著。然后，在涂有纖連蛋白和膠原蛋白的培養皿擴增培養。材料與儀器D-PBSA無血清角質形成細胞培養液胰蛋白酶EDTABiocoat6孔培養板步驟一、材料滅菌無血清角質形成細胞培養液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics):含有0.15mmol/LCa2-、0.1ng/ml人上皮生長因子、5ug/ml胰島素、0.5ug/ml氫化可-的松和30ug/ml牛垂體提取物。EMEM(Eagle'sminimalessenti

過濾裝置的滅菌2022/12/06

材料與儀器過濾器外殼架子預過濾器玻璃纖維尼龍袋高壓滅菌無菌指示膠帶消毒鍋步驟1.用清潔劑完-全淸洗后，用水沖洗過濾裝置，然后用去離子水沖洗，并晾干。2.在過濾器中插入濾板，然后將過濾膜放到濾板上，如果過濾膜是由多聚碳酸鹽制成的，要弄濕以消除靜電。3.將預過濾器（玻璃纖維和其他需要的物質）放在過濾器的頂端。4.安裝過濾器支架，不要完-全擰緊（可以留一個螺圈）。5.過濾器的進口與出口均用鋁箔封住。6.用消毒紙或蒸汽可滲透的尼龍膜將過濾裝置包好，貼上無菌指示膠帶。7.在121°C，100kPa(1ba

放射自顯影術實驗2022/12/06

簡介培養細胞的放射自顯影術射性既可以研究細胞本身的物質代謝之外，還可用來分析細胞的動態活動、細胞周期等。原理培養細胞放射自顯影術原理是將培養細胞的放射性同位素釋放射線，作用于感光乳膠，使感光乳膠中的鹵化銀感光形成潛影，再經顯影劑作用，感光的鹵化銀還原成黑色的銀顆粒，未感光的銀鹽則經定影去除，在乳膠中留下清楚明確的圖像。材料與儀器器材：①培養的細胞②細胞傳代培養的設備③直徑3.5cm塑料培養皿（或50ml培養瓶）④2.2cmx2.2cm蓋片（或自裁成6mmx40mm，放入培養瓶）⑤曝光鉛盒或黑色塑

脂質體介導的瞬時轉染2022/12/06

材料與儀器L8057-Y10細胞D-PBSA培養瓶培養板F12FB培養基G418(Invitrogen)選擇性培養基電穿孔電穿孔專用杯電穿孔儀II電穿孔儀-II配套的效能擴增器-Plus步驟表達載體與DNA制備：pSVTKGH，線性化[Seldenetal.，1986]此載體含有SV40增強子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子序列，兩者可啟動人類生K激素（hGH)基因表達。hGH可直接分泌到組織培養基上，可通過放射免疫學分析法直接檢測[Ravidetal.，1991]。pcDNA3，線性化（Invit

非肌肉肌動蛋白的純化2022/12/06

材料與儀器非肌肉肌動蛋白DNA酶Ⅰ緩沖液DEAE柱步驟1.準備貯存液和材料。2xDNA酶Ⅰ緩沖液：20mmol/LTris-HCl，pH8.01mmol/LDTT0.4mmol/LCaCI20.4mmol/LATP抑蛋白酶肽抑蛋白酶亮抑蛋白酶肽抑胃酶肽APMSFTPCK50%甲醛在DNA酶柱緩沖液中0.4mol/LNH4CI在DNA酶Ⅰ緩沖液中0.3mol/LKCl在DNA酶Ⅰ緩沖液中DNA酶Ⅰ柱緩沖液2.準備一個5~10ml的DNA酶Ⅰ的親和柱。3.準備一個0.2~1ml的DEAE柱：用DNA

倒置顯微鏡的使用2022/12/05

原理將培養物放在顯微鏡的載物臺上，打開電源，選擇合適的鏡頭，聚焦于標本。如果必要的話，將聚光器和相差環調節在中心。材料與儀器倒置顯微鏡擦鏡紙步驟確保顯微鏡（配有相差10×、20×或40×的物鏡及聚光器和合適的相差環）潔凈（用70%乙醇擦拭載物臺。如果有必要，用擦鏡紙清潔物鏡）。2.打開電源，將燈光強度從最-低開始調至合適的強度，而不是直接打到強光。3.檢查光源與聚光器的銜接：(a)將一張染色切片、培養瓶或培養皿放在載物臺上；(b)關閉視場光圈；(c)聚焦在可變光闌上；(d)將可變光闌成像調整到視

大鼠肝細胞分離實驗2022/12/05

原理經肝門靜脈或肝門靜脈分支插管，用無鈣緩沖液灌洗肝15min，再用酶溶液灌洗15min。收集和洗滌細胞，計數有活力的肝細胞。材料與儀器L-15Leibovitz培養液HamF12培養液胞培養液HMMSF無鈣HEPES緩沖液膠原蛋白酶液5%戊芭比妥鈉肝素聚乙稀管一次性20G頭皮靜脈輸液針縫合線l注射器水浴箱蝠動泵步驟一、材料1.無菌（1）L-15Leibovitz培養液（2）HamF12培養液或WilliamE培養液：80～100ml，含有0.2%牛白蛋白（V級，Sigma)和1ug/ml牛胰島

蛋白質合成實驗2022/12/05

材料與儀器步驟材料無菌細胞培養，如1X104～1X106個細胞，24孔板3H-亮氨酸。無血淸培養基中2MBq/ml(～50uCi/ml)(特異活性并不重要，因為它將由培養基中的亮氨酸濃度決定）非無菌SLS或SDS，1%(35mmol/L)溶于0.3mol/LNaOH三氯醋酸（TCA)液閃瓶Eppendorf管閃爍液，最小含水為10%操作步驟1.細胞生長至所需密度。2.從孵箱中取出培養板，加人預溫的溶于培養液或BSS中的放射性同位素，稀釋度為1:10(如l00ul/ml/孔）。3.盡快地將細胞放回

分離ARVM細胞2022/12/05

材料與儀器鼠KH緩沖液混合氣體對流工作臺或層流式超凈臺乙酉迷罩冷凝器循環水浴和水浴搖床圈型架蠕動泵臺式醫用離心機無菌燒杯ColorpHastpH試紙步驟一、ARVM細胞分離的準備工作1.準備如下設備及器材：對流工作臺或層流式超凈臺乙酉迷罩冷凝器循環水浴和水浴搖床帶夾的圈型架免蠕動泵臺式醫用離心機95%O25%CO2混合氣體400ml無菌燒杯ColorpHastpH試紙（精密型）2.在對流式或層流式工作臺中，裝配Langedorff系統，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動泵。冷凝器連

多潛能干細胞的誘導2022/12/02

簡介多潛能干細胞（in-ducedpluripotentstemcells，iPS）技術不僅可以解決胚胎干細胞來源引起的倫理問題，而且自體iPS細胞可以避免異體來源胚胎干細胞移植引起的免疫排斥反應。目前就成體細胞誘導產生iPS細胞相關的幾種轉錄因子以及誘導方法、如何提高誘導產生iPS細胞的效率以及iPS細胞臨床應用方面都是在Yamanaka報道的誘導方案基礎上的改良。原理Yamanaka法誘導多能干細胞的原理是把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引

E玫瑰花環形成試驗2022/12/02

原理正常人外周血中T細胞在體外能直接和綿羊紅細胞（SRBC）結合形成玫瑰花樣細胞團。這是因為人的T細胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相結合的受體，稱為E受體。已證實E受體是人T細胞所*的表面標志，因此本試驗可作為人外周血T細胞的鑒定和計數，同時作為人細胞免疫功能狀態的一個檢測指標，也是分離T細胞的常用方法之一。本實驗為示教內容，學生只看結果。材料與儀器肝素抗凝人外周血淋巴細胞分層液SRBC懸液Hank's液NBS血球計數板尖吸管載玻片瑞氏染液步驟1.取肝素抗凝血1ml加1mlHank's液，混

大鼠肝癌模型法2022/12/02

原理1.Wnt/β-catenin信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路。在正常的體細胞中，β-catenin只是作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復合體對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發揮作用。只有當細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結合激活胞內的dishevelled（散亂的）蛋白導致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運,β-catenin才能在胞質中積累起來。2.當胞質中B-catenin的濃度達到一定水平時

端粒顯示實驗2022/12/01

簡介端粒（telomere）是真核細胞染色體末端的DNA重復序列，它與多種端粒結合蛋白結合在一起，發揮重要的生物學功能，在細胞分裂的過程中，盡管端粒也會不斷的縮短，但可以通過端粒酶的催化，以自身RNA為模板進行補充，從而代償了這一損失。端粒的功能保護染色體末端完整性，穩定染色體，保障染色體DNA在復制的過程中不被縮短，保護染色體結構基因，防止基因組DNA降解、防止染色體末端融合，調節細胞生長、衰老等作用。目前，用于端粒顯示實驗的方法主要有3種：Southern印跡法、Q-FISH法和qPCR法。

蛋白質分離實驗2022/12/01

簡介蛋白質分離的方法主要有3種：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質、免疫沉淀法分離蛋白質和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質。原理SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質的基本原理是蛋白質在SDS和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵打開，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，聚丙烯酰胺（PAGE）是一種具有三維結構的網狀高分子聚合物，具有分子篩的作用。蛋白質在PAGE電泳中向正極遷移，遷移速率取決于分子的大小、電荷及其空間結構。SDS帶有較強的負電荷，不同的蛋白質與之結合后具有相同的荷質比，

EB病毒轉化成淋巴細胞2022/12/01

材料與儀器全血刀豆凝集素ARPMI生長培養基離心管步驟混合10ml全血和10mlRPMI生長培養基。生長培養基（RPMI1640800ml，FBS200ml，2mmol/L-谷氨酰胺，5μg/ml兩性霉素，50μg/ml慶大霉素）2.取15ml無菌離心管，加3mlHisto-paque1077（Sigma），在其上加4ml稀釋血，分離淋巴細胞。3.室溫300g離心30分鐘，棄上層清亮血漿。4.收集不透明淋巴細胞層，細胞懸液倒入50ml無菌離心管。5.20mlRPMI1640生長培養基洗兩次，室溫