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2010
03-29

甲基化相關的基因型
甲基化相關的基因型dam（DNAadeninemethylase）功能：dam基因表達DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列GATC中A的甲基化，保證DNA免受限制性核酸內切酶MboI的切斷，同時在DNA復制時也起一定的輔助作用。dam基因的變異導致腺嘌呤（A）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤（A）不被甲基化，易于獲得非甲基化質粒。dcm（DNAcytosinemethylase）功能：dcm基因表達DNA胞嘧啶甲基化酶，它能特異性識別DNA雙鏈上的CCWGG序列，并使第二個C甲基化，即CmCWGG
2010
03-29

基因重組相關的基因型
基因重組相關的基因型recA（Recombination）功能：recA基因表達ATP依賴型DNA重組酶，它在λ噬菌體與基因組DNA的溶原重組時起作用，同時具有對DNA放射性損傷的修復功能。由recA基因的變異所產生的基因型使同源或異源DNA的重組不能進行，保持插入DNA的穩定性，對DNA的轉化有利。一個菌株的基因型如果是recA，則說明此菌株的表現型是重組缺陷的。recB（Recombination）功能：recB基因表達ATP依賴型DNase和核酸外切酶V的一個亞基，對recA的DNA重組酶
2010
03-24

Northern blot技術
Northernblot技術經乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進行的RNA電泳這一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。含有乙二醛－DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進行電泳，因為前者泳動速率較慢而且需將電泳液時行循環以避免電泳過程中形成過高的H＋梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝膠對RNA進行分級離，通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。1）在滅菌的微理離心管內，混勻下列液體：6mol/L乙二醛5
2010
03-24

植物組織RNA提取
植物組織RNA提取的難點及對策從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學研究，都需要高質量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關鍵所在。a）*Y（WL從文獻報道上看，有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA，而阻礙了其分子生物學方面研究的進展。一般認為在這些植物組織中，或富含酚類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無法
2010
03-15

復蘇方法
復蘇方法1．從液氮罐中取出安剖；有時因安剖未封嚴，浸入了液氮，取出后因安剖內液氮迅速氣化而發生爆炸，因此應帶有防護眼睛和手套。2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍。3．剪開紗布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋，用吸管吸出細胞懸液，裝入離心管中，再補加10ml培養液，吹打使細胞懸浮。4．低速離心（500～1000轉/分）5分鐘，取上清后再重復用培養液漂洗、離心。5．加入培養液適當稀釋后，再移裝入培養瓶中，置溫箱培養，次日更換一次培養液后再繼續
2010
03-15

蛋白質提取的方法
蛋白質提取的方法總匯1、植物組織蛋白質提取方法1、根據樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據材料不同適當加入），準備提取液放在冰上。2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時）。3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g這種
2010
03-15

幾種常用轉化細胞的轉化
幾種常用轉化細胞和轉化技術1）致癌化學物轉化細胞：轉化敘利亞地鼠胚胎細胞實驗1．取材：妊娠后第13天取材，取數個同窩胚胎，去頭和內臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0.25％胰蛋白酶（含0.01％EDTA）37℃消化30分鐘，濾過、低速離心、吸除消化液、加入營養液、制備成細胞懸液、接種入75cm/培養瓶中，接種密度10～20×106/75cm，37℃培養2～3天，在順利情況下能迅速長滿瓶面。2．貯存：選大批生長狀態良好的細胞凍存，儲以備用。3．致癌物處理：取凍存細胞，解凍，接種于25ml培養瓶
2010
03-10

如何提高RT-PCR反應體系的靈敏度
如何提高RT-PCR反應體系的靈敏度：1、分離高質量RNA成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的大值。2、使用無RNaseH活性的逆轉錄酶在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引
2010
03-08

影響質粒提取的因素
影響質粒提取的因素：質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養條件、細胞的裂解、質粒拷貝數、質粒的穩定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。宿主菌種類質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，多數情況下我們是從大腸桿菌中提取質粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質粒提取的質量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質量的質粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會在裂解時產生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。另外，有些菌株有非常高的內切酶活性
2010
03-08

質粒提取原理及流程
質粒提取原理及流程：較常用的質粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質粒（15kb）。堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在回到中性時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分
2010
03-08

質粒DNA分離和純化
質粒DNA分離和純化：純化要求質粒DNA中不應存在對后續實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續實驗對于質粒純度的要求不同，常規的分子生物學實驗（如酶切、測序等）普通純度的質粒即可滿足實驗，而對于轉染實驗，要求質粒的純度較高（如高純度或無內毒素）。可以選擇不同的質粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。純化方法用硅基質材料吸附質粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩
2010
02-27

Lowry法蛋白濃度測定
Lowry法蛋白濃度測定目錄號規格價格PC0030-10001000T280.00產品簡介：Lowry法包括兩步反應：*步是在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；第二步是此絡合物將Folin試劑還原，產生深藍色，顏色深淺與蛋白質含量成正比。定量范圍為5～100μg/ml蛋白質。Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。Lowry法測定較為不受脂類物質干擾，適
2010
02-27

BCA蛋白濃度測定
BCA蛋白濃度測定目錄號規格價格PC0020-500500T280.00產品簡介：Bicinchoninicacid（BCA）法是在世界上常用的蛋白濃度檢驗方法之一BCA法基礎上改進而成。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環境下蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu+。兩分子BCA與一個Cu+螯合形成穩定的紫藍色復合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質濃度成正比，據此可測定蛋白質濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱
2010
02-27

Bradford蛋白濃度測定
Bradford蛋白濃度測定目錄號規格價格PC0010-25002500T150.00產品簡介：Bradford法是常用的蛋白質快速定量方法。CoomassiebrilliantblueG-250與蛋白質結合使染料的大吸收峰由465nm變為595nm，溶液的顏色由棕色變為蘭色，595nm波長下吸光度值與蛋白含量成正比。靈敏度比Lowry法高4倍，與BCA法相當。反應迅速，2分鐘即可達到平衡并在1小時內保持穩定。操作簡便，只需要一種反應試劑。干擾物質少，鈉鉀鎂離子、Tris、葡萄糖和蔗糖、甘油、巰
2010
02-27

蛋白電泳（PAGE）
蛋白電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺（簡稱TEMED）和催化劑過硫酸銨（簡稱AP）或核黃素（即vitaminB2）的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）SDS－PAGE是在要電泳的樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇（或者DTT）的樣品處理液，SDS可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的
2010
02-04

基因組DNA提取的原則
基因組DNA提取的原則1、保證核酸一級結構的完整性（因為遺傳信息全部儲存在核酸一級結構中，故完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的基礎）。2、排除其它分子（如蛋白質、多糖、脂類、有機溶劑等）的污染，使下游試驗順利進行。
2010
02-02

胍鹽/β-巰基乙醇法
胍鹽/β-巰基乙醇法適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。在這種方法中，胍鹽使細胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNase的活性，保護RNA不被降解。
2010
02-02

異硫氰酸胍/苯酚法
異硫氰酸胍/苯酚法異硫氰酸胍/苯酚法是一種傳統的RNA提取方法，適用于大部分動植物材料，但對于次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚/氯仿混合液抽提，低pH值的酚將使RNA進入水相，而蛋白質和DNA仍留在有機相，從而可以完成RNA的提取工作。Solarbio公司的Trizol和總RNA提取試劑盒就是基于異硫氰酸胍/苯酚法開發的一種總RNA提取試劑和試劑盒。Trizol法應用非常廣泛，適用于包括動物組織、微生物材料、培養細胞
2010
02-02

DNA的儲存
DNA的儲存儲存溶液：DNA為兩性解離分子，在堿性條件下較穩定，因此一般用TE（pH8.0）保存。TE的成分為：10mMTris-HCl（Tris與鹽酸形成強的緩沖對）；1mMEDTA（乙二胺四乙酸，能螯合二價金屬陽離子，抑制DNase的活性）；pH8.0（堿性條件可減少DNA的脫氨作用，防止降解）。ddH2O的正常pH值為7.0，可作為DNA的儲存液，但有些實驗室制備的ddH2O呈酸性（pH值小于7.0），這不僅影響DNA的洗脫效率，而且導致長時間保存的DNA容易發生降解。因此建議用TE作為D
2010
01-26

RNA純化及獲得
RNA純化及獲得純化要求RNA樣品中不應存在對酶（如逆轉錄酶）有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。純化方法及沉淀1、有機溶劑抽提法氯仿抽提：在使用RNA提取試劑進行RNA提取時，常使用氯仿進行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質，并促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA的目的。沉淀：氯仿抽提RNA后，一般采用異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，

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