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電穿孔法進行質體的轉形2010/11/25

儀器用具：37℃培養箱及冰浴Electroporationcuvette（electrodegap,0.1cm）Electroporator（Bio-Rad,IBIgeneZapper或其它廠牌）藥品試劑：無菌水（置冰浴中）10%glycerol（置冰浴中）SOB液體培養基SOB固體培養基SOC液體培養基SOC/Amp固體培養基大腸桿菌JM109Ligationmixtures方法步驟：菌體的處理：1）進行轉形實驗的前16~20h，將菌種JM109接種在SOB固體培養基上，并在37℃培養箱中培養

標記蛋白的概述2010/11/24

從建立了克隆表達技術以來，將2個編碼區域融合構建一個具有2個起始多肽特性的新蛋白，已廣泛應用于科學研究中。下圖利用來源于c-myc蛋白表位結構的詳細知識，構建了一個可供商品化抗體識別的新蛋白。這種方法已經成為分子克隆的主要技術，任何新識別的編碼區均可通過在多肽上加一個表位序列，即可被特異性抗體識別。亦可將其他感興趣的蛋白或功能區的編碼基因與研究中的抗原基因融合，如將所研究的蛋白質編碼基因與谷胱甘肽—S—轉移酶（GST）基因融合，并可在E．coli中合成一個可溶性蛋白，該蛋白可通過與谷胱甘肽珠結合

免疫親和純化的操作步驟2010/11/24

1．主要內容純化率為1000～10000倍。快速純化抗原，層析柱?？芍貜褪褂??？色@得純化的抗原。不能用于定量測定。純化效果取決于抗原的濃度和抗體的親和力需要適當純化的抗體。2．操作步驟（1）將抗體結合到蛋白A或蛋白G微珠上。對于一般用途的層析柱，每毫升濕的微珠大約可以結合2mg單克隆抗體或親和純化的多克隆抗體。將抗體和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的勻漿，在總量為10ml的溶液中加入大約lml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。（2）用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉（pH9．0）洗滌微珠2次，

親和純化抗體的制備2010/11/24

將純化的抗原與微珠共價結合，免疫親和純化技術可以用于分離抗特定抗原的特異性抗體。這種方法通常使用多克隆抗體，因其對相應抗原和污染的抗原具有多種活性。識別多種抗原的問題會使很多免疫化學技術發生混淆。這一問題可以對抗原特異抗體進行純化而得到解決。另一種用于抗體免疫親和純化的方法是濃縮特異性抗體，此法常用于抗多肽抗體的制備。這些抗體僅偶爾用于親和純化后。純化抗體的方法學和理論與上述步驟相同，將抗原與微珠共價偶聯，然后和抗體結合，再進行洗脫。

FLAG標記物2010/11/24

序列AspTyrLysAspAspAspAspLys（DYKDDDDK）抗體鼠源單抗MI和M2供應商Sigma-Aldrich，其他供應商商品化試劑在E．coli和酵母表達系統的氨基末端和羧基末端標記載體純化和標記的抗體以及親和樹脂純化多肽非商品化試劑在E．eoli，酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞中表達的多種載體FLAG標記物是惟一專為標記目的設計的多肽標記物（Hoppetal．1988），其特點是標記物的序列不是來自任何已知的蛋白。該標記物是由8個氨基酸殘基組成的多肽，具有親水性，可置于蛋白

用于純化的肽標記物2010/11/24

zui近通過噬菌體呈現技術得到了另外一種適合于進行蛋白純化的多肽標記物。多肽AWRHPQFGG可與鏈霉親和素結合。鏈霉親和素標記物系統（Schmidtetal．1996）不受保護的影響，而且短的鏈霉親和素標記物多肽序列可以標準的方法引入到感興趣的開放閱讀框中。鏈霉親和素柱可從商業渠道獲得。通過X射線晶體衍射技術已經發現天然配體生物素和鏈霉標記物多肽在鏈霉親和素的同一區域與之發生結合，且被鏈霉親和素標記的蛋白可通過二氨基生物素進行洗脫。純化的肽標記物純化標記物純化配體標記物來源序列說明文獻鏈霉標記

采用PCR技術插人表位標記物2010/11/24

許多表達載體可能沒有能夠克隆標記物的合適的限制性酶切位點。在這種情況下，采用PCR技術將多肽標記物插入到已經克隆化的開放閱讀框。在設計PCR正向和反向引物時，可引入較長的片段以在蛋白的氨基或羧基末端引入多肽標記物。，選擇用于編碼標記物特定氨基酸的密碼子，使其能夠用于表達標記蛋白的生物系統中。引物設計時應加入新的限制性酶切位點，以便PCR產物的克隆。應在引物限制性部位5，端添加額外的堿基，這些“增添”的堿基有利于限制酶對PCR產物進行有效的切割。同時需注意保持正確的閱讀框和根據需求設計起始密碼和終

表位作圖方法的選擇2010/11/24

目前已有許多可供選用的蛋白質抗原表位作圖方法，如用于研究抗原抗體復合物晶體結構，或分析龐大的隨機肽鏈序列庫等。競爭分析法、基因表達分析法和合成肽鏈分析法等是應用以及技術zui成熟的方法。推薦使用表位作圖方法和基本條件方法構象表位線性表位條件度競爭分析法是是標記抗體，抗原僅確定空間位置競爭基因片段表達法是，但并非經常是必須克隆，DNA（已知基因序列）構象50--200個氨基酸線狀10--20個氨基酸合成肽庫法否是必須建立肽庫*繪制3—15通過競爭分析法進行表位作圖是應用非常廣泛的一種方法，該法能夠

競爭分析作圖法實驗原理2010/11/24

確定2種單克隆抗體是否結合蛋白質抗原上同一位點的zui簡便的方法是競爭分析法。該方法可確定一種抗體是否對另一種抗體與某一位點的結合具有抑制作用。如果兩者相互競爭，說明2種抗體識別相同位點或同一蛋白質的空間折疊結構域。相反，如果2種抗體與抗原結合無相互競爭抑制作用，能夠同時與抗原結合，說明2種抗體具有不同的特異性，所識別的抗原表位也不同）。競爭試驗競爭分析法對單克隆抗體的特異性分析zui為有用，而多克隆抗血清可識別多種不同的位點，故不宜用此法分析。檢測抗原與抗體間相互競爭結合試驗的方法較多，但其中

競爭分析作圖法操作方法2010/11/24

1．試劑和溶液PBS；PBSTween（0．05％）；PBSPBA（PBS加1％BSA），不加疊氮鈉；0．1mol／L碳酸氫鈉緩沖液，pH9．6；鏈霉親和素—過氧化物酶結合物；兔抗鼠IgG-過氧化物酶結合物；YFPl；生物素標記ZO-1抗體；末標記的ZO-1抗體；未標記的XHl和XH2抗體；未標記的對照單抗PCI0；TMB底物（50mi50g／L儲存液，5ml0．1mol幾醋酸鈉pH6．6，lmlH202）。2．試驗抗體和對照抗體的活性和滴度測定（1）YFPl儲藏液的制備：用0．1mol／L（p

基因片段表達作圖法2010/11/24

已有許多方法，包括已商品化的試劑盒（Novatope），被用來在一個表達載體系統中進行隨機的或特定的開放閱讀框基因片段的表達。然后測定基因片段庫與特定抗體的反應性，并進行作圖。與抗體結合的基因片段序列特性，可以通過測序分析證實。在許多實驗中，研究者可事先將所研究的基因片段庫克隆在表達載體中。其中的基因片段可能是不完整的cDNA片段，所有這些片段均可以通過簡單的免疫化學方法鑒定其中是否存在有相關的抗原表位。如果抗體與目的抗原在免疫印跡中具有較強的反應，說明可采用同樣的方法分析任一表達的基因片段。如

合成肽表位作圖法2010/11/24

在這種方法中，需合成一系列末端相互重疊的肽鏈，每段都對應于蛋白抗原線狀序列中的一小段，并將它們排列于固相上。用檢測抗體識別這些固相肽鏈，與之結合的特異性抗體，采用酶標記的二抗檢測。這種方法快速、成功率高。如果使用的抗體在免疫印跡反應中效果較好，此法所得結果清晰，并能識別那些耐變性的蛋白表位。在實際實驗中并非所有的抗體均能很好的反應，抗體僅對那些具有耐變性特性的蛋白質反應較好。系列肽鏈的設計如果時間和經費都允許，合適的肽鏈應該zui大可能地覆蓋所要作圖的表位（每段肽鏈15～20個氨基酸），而且每段

系列肽的合成或購買2010/11/24

許多商業性公司可以提供合成肽，或商業化的試劑盒，或用于實驗室的合成儀。但都價格昂貴。肽鏈的合成可以采用特制的聚乙烯大頭針作支持體的超微量固相多肽合成技術，在塑料微量滴定盒或在紙上進行。系列肽可以直接在固相支持物上用抗體檢測，或者從固相支持物上切割下來再進行分析。如果需要的只是對1～2種抗體識別的表位作圖，回答“是”或“不是”，那么該系統就已足夠，而且十分經濟。如果待測抗原是一個實驗室中的大項目，建議購買那種具有游離生物素結合的、在生物素和同源肽序列間有4個氨基酸間隙的肽。購買此種肽鏈一般是lmg

生物素標記肽的檢測方法2010/11/24

1．準備工作該檢測是在96孔微板上進行，每孔均先用鏈霉親合素包被，分別依次加入待進行表位作圖的肽系列，并用需定位的抗體檢測。2．試劑和溶液0．1％PBS-Tween；2％BsA／PBS；0．1％（wt／v01）BSA／PBS；肽；過氧化物酶標記的第二抗體；TMB底物（取50／xl50g／LTMB儲存液，加入5ml0．1m01醋酸鈉，pH6．6，另加1ul過氧化氫）；100btmol硫酸。3．操作步驟（1）干肽溶于100％DMSO中，使其貯存液的濃度為10mg／m1，工作液的終濃度為lmg／ml，

表位作圖2010/11/24

早期表位作圖或定位（epitopemapping）主要是采用精細的、但十分繁瑣的蛋白質化學方法。這些方法是基于蛋白質修飾和降解的原理，可經側鏈化學修飾法選擇性地標記氨基酸，失去結合的部分將被測出。蛋白質抗原被降解為小片段，經測序后確定抗體結合的位點。雖然其結果在蛋白化學中是非常的例子，但是要確定某一抗原的全部表位需要大量的時間。分子克隆技術和肽鏈合成方法的進展極大地促進了表位作圖方法的改進?，F已可以通過誘變、蛋白質合成或蛋白競爭結合方法鑒定其表位。此外，表位序列測定的應用對抗體結合表位的分析具有

透析袋的準備2010/11/24

有些透析袋不需要處理，根據供應商品的說明決定是否進行處理。1．剪取適當長度的透析袋。通常長度為10cm、20cm和30cm。2．將透析袋放入大體積的5mm01／LEDTA，200mm01／lN9HC03溶液中。3．煮沸5min。傾棄EDTA／NaHC03液，用去離子水輕輕漂洗。再加大量的5mm01／LEDTA，200mmol／L溶液并煮沸5min。在上述步驟中，應注意透析袋一定要浸泡于溶液中。4．棄去第二次洗液，*用去離子水清洗；然后，加入大量的去離子水漂洗并蓋好（是用鋁箔）。5．高壓滅菌10m

氣相色譜法測定氯霉素CAP殘留2010/11/13

（1）試劑和材料除另有規定外所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或相當的去離子水。①乙酸乙酯：重蒸餾②甲醇：重蒸餾③正己烷：重蒸餾④丙酮：重蒸餾⑤硅烷化試劑：3ml六甲基⑥氯化鈉水溶液：1mol／L⑦氯霉素標準品：含量≥99．5％⑧氯霉素標準溶液：準確稱取適量的氯霉素標準晶，用丙酮配成o．10rug／mi的貯備液，根據需要稀釋成適當濃度的標準工作液。（2）儀器和設備①氣相色譜儀：配有電子俘獲檢測器②均質器③離心機：3000r／mtn④多功能微量化學樣品處理儀或其他相當的儀器⑤具塞離心管：5ml⑥離心管

液相色譜法測定氯霉素CAP殘留2010/11/13

（1）試劑和材料除另有規定外所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或相當的去離子水。①乙酸乙酯：分析純②甲醇：紫外光譜級⑧正己烷：分析純④高氯酸：分析純，o．5mol幾⑤氯霉素標準品：含量≥99％⑥氯霉素標準溶液：準確稱取適量的氯霉素標準晶，用甲醇配成o．10mg／m1的標準貯備液，根據需要吸取適量貯備液，將甲醇吹去后用o．5mol／L高氯酸溶液配制成癥當濃度的標準工作液。（2）儀器和設備①液相色譜儀：配有紫外線檢測器②均質器：10000r／mln③離心機：3000r／Hill）．④微量注射器：25,~

氣/質聯用法測定氯霉素CAP殘留2010/11/09

（1）試劑和材料以下所用的試劑，特別注明外均為分析純試劑；水為符合GB／T6682規定的二級水。①氯霉素：含氯霉素不得少于99．o％②丙酮：色譜純③甲醇：色譜純④乙酸乙酯：分析純⑤正己烷：分析純⑥4％氯化鈉溶液：稱取適量的氯化鈉，配制成濃度為4％的氯化鈉溶液⑦硅烷化試劑：BSTFA+TMCS，99；l，lml／瓶⑧氯霉素標準貯備液：稱取氯霉素約50mg，105~（2干燥4h，精密稱量，置于50ml棕色容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度為lmg／ml的貯備液，置4℃冰箱中密封保存，

飼料中的動物源性成分鑒別技術2010/11/09

自1987年英國首先發生瘋牛病以來，隨后*許多國家都相繼發現了瘋牛病，大量的證據表明：飼喂被朊蛋白（prion）污染的反芻動物源性蛋白是瘋牛病傳播的主要途徑，為此世界上許多國家和地區都先后頒布了法律，法規以控制動物源性成分的使用。1994年歐盟和1997年美國都制定了法規禁止在反芻動物的飼料中添加反芻動物源性蛋白，1996年世界衛生組織建議所有的國家禁止在反芻動物的飼料牛添加反芻動物源性蛋白，2000年歐盟將這項禁令擴大到禁止向用于食用的動物飼喂加工過的哺乳動物、鳥類和魚類蛋白成分。我國新頒布的