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2018
05-21

流式檢測 T 細胞增殖的技巧
集中于T細胞的許多基礎和臨床免疫研究包括增殖測定，都是為了確定T細胞是否能夠在不同的體外或體內條件下增殖。流式細胞儀術是測量T細胞增殖的理想方法，現在有一套染色產品，可以在現有的流式細胞儀染色板中加入增殖染料。與所有流式細胞術染色步驟一樣，一定要做一個預實驗確定染色試劑的用量和確定采集的細胞數，在下一個T細胞實驗確定使用其中的一個染色方案來檢測細胞的增殖。胞內熒光染色：羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯（CFSE）或類似的熒光染料是可以進入活細胞內的。在增殖期間，隨著細胞分裂熒光染料的濃度也隨之稀釋
2018
05-17

重組蛋白分離純化的基本原則
不管黑貓白貓，抓到老鼠就是好貓，對純化來講亦如此，能拿到純度好的蛋白，符合純化要求就是硬道理。不同蛋白純化工藝不同，即使相同的原料也有不同的純化方案。蛋白質純化方法的選擇主要是利用不同蛋白質之間的相似性與差異，依據蛋白之間的相似性可以去除非蛋白物質，在根據蛋白的差異性將目的蛋白分離出來，所以要取得好的純化結果所可以采用的策略及原則卻是共通的。1.針對不同的產物表達形式采用不同的策略：a)融合型表達重組蛋白，一般胞內可溶性的，擬選用親和層析進行純化；b)分泌型表達的重組蛋白，通常體積大、濃度低，因
2018
05-17

細胞固定對抗體熒光強度的改變
多聚甲醛固定后，白細胞的免疫表型通常會有所變化。而且，在固定之后，對細胞表面Marker的熒光穩定性也會產生很大影響。為了獲得不同表面Marker的熒光穩定性，了解固定后細胞的光散射特性和射門以及固定細胞后產生自發熒光是非常必要的。在固定細胞0、2、4、6、24、48、96h后，用FITC標記抗體對全血進行染色測定。通過檢測可溶性熒光素當量分子(MESF)來定量分析熒光強度。結果顯示出，固定作用48h后，細胞大小（FSC）和細胞顆粒度(SSC)能夠引起顯著的下降，在單核細胞中，固定作用96h后，
2018
05-16

免疫磁珠技術
免疫磁珠（Immunomagneticbead,IMB）技術是20世紀80年代出現的技術方法。以免疫學為基礎，滲透到病理、生理、藥理、微生物、生化及分子遺傳學等各個領域，其在免疫檢測、細胞分離、生物大分子純化和分子生物學等方面有著越來越廣泛的使用。免疫磁珠的結構：磁珠是由核心金屬顆粒（Fe2O3,Fe3O4）,核心外層包裹的高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯）和zui外層的功能配基（如-NH2，-COOH、-OH、-CHO）組成。免疫磁珠在生物醫學領域的應用：1.細胞分選免疫磁珠細胞分選可在幾分鐘
2018
05-16

大腸桿菌表達外源蛋白的策略
大腸桿菌表達系統是發展zui早、目前zui為成熟的表達系統。因其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產物容易純化、穩定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等，是基礎研究和商業生產重組蛋白的強大工具；但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點：如重組蛋白不穩定，生物活性低，以包涵體形式表達。外源基因在大腸桿菌中的表達效率受多個因素的影響，在表達前對目的蛋白進行分析和優化，才能實現目的蛋白的表達，主要包括如下幾個方面：(1)表達載體的選擇，表達載體啟動子的選擇很重要，啟動子的結構影響了它與R
2018
05-15

DNA 甲基化修飾
DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，能通過影響染色質結構、DNA構想、穩定性以及蛋白質相互作用方式等，起到調控基因表達的作用。與多種腫瘤的發生、發展密切相關。DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發生的一個重要因素。這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態。它是由DNA甲基轉移酶（DNAmethy-transferase，Dnmt）催化，以3-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體而發生反應。催化反應有3類，包括將腺嘌呤轉變為N-甲基腺嘌呤、將胞嘧啶轉變為N-甲基胞嘧啶以及將
2018
05-15

His 融合蛋白純化常見問題解答
蛋白過鎳柱純化的原理：Ni-NTA純化介質純化帶有His6-Tag的融合蛋白是目前蛋白純化中zui常使用的一種方法。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs(組蛋白)標簽的堿性蛋白蛋白結合，組蛋白標簽一般是6個組氨酸(堿性氨基酸)。在蛋白上樣后，帶有組氨酸標簽的蛋白特異性結合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳也可以與咪唑結合，采用咪唑洗脫，咪唑競爭性結合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。上樣，清洗，洗脫，基本三個步驟就結束
2018
05-14

多色流式實驗熒光素的選擇
流式細胞儀已經成為臨床醫生、免疫學家和細胞生物學家*的工具，這項技術在不斷進步。流式細胞儀的多參數細胞分析這一*的功能讓大多數細胞分析成為了可能。Coon首先提出了熒光抗體標記細胞內的目的蛋白技術，在20世紀80年代，細胞亞群僅僅通過檢測單一的細胞表面標志物來確定，使用的單抗和熒光素很受限制。基因表達技術的誕生和新的單抗以及熒光素的獲得使更復雜的多參數分析成為可能。1.常用熒光素的種類及特性1）.FITC（Fluorescein）又稱異硫氰酸熒光素，其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光
2018
05-14

貼壁、懸浮、原代細胞感染Protocol及常見問題解答
慢病毒是當前zui熱門的基因操作工具，其感染譜廣，可有效地感染腫瘤細胞、神經元細胞、心肌細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而為基因功能的研究提供了更強有力的工具。然而仍有一部分細胞，尤其是原代細胞和懸浮細胞由于細胞特性，很難獲得的感染效率。為了提高細胞的感染效率，我們常常選擇多加病毒或使用Polybrene等助感染試劑，然而細胞狀態卻變差了，且增加感染效率并沒有達到理解的效果，這是什么原因呢？一、對慢病毒感染出現的問題進行原因分析1.細胞狀態變差——細胞毒性雜質：病毒溶液中殘留的雜質蛋白
2018
05-11

如何提高PCR產物克隆的效率
把PCR產物克隆到載體上常見有3種做法：1.直接克隆到T載體（或者U載體上）2.引物設計時引入酶切位點，PCR產物酶切后直接克隆到目標載體上3.將平末端PCR產物直接克隆到平末端酶切載體上。方法3主要是針對高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEnglandBiolabs公司的Vent酶，以及QIAGEN公司新出的同時具有熱啟動功能的高保真ProofStart酶，進行PCR擴增，由于這類酶有很強的校讀功能，能夠以模版為準切掉錯配的堿基，因而得到的PCR產物多數是平末端，不能
2018
05-11

PCR擴增產物的檢測分析
PCR擴增反應完成之后，必須通過嚴格的鑒定，才能確定是否真正得到了準確可靠的預期特定擴增產物。凝膠電泳是檢測PCR產物常用和zui簡便的方法，能判斷產物的大小，有助于產物的鑒定。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者主要用于DNApian段大于100bp者，后者主要用來檢測小片段DNA。1．瓊脂糖凝膠電泳這是實驗室zui常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下
2018
05-10

PCR擴增產物的克隆
PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。平端連接法實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoRV或SmaI切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的V
2018
05-10

脂肪組織和細胞的總蛋白提取
脂肪組織特別是白色脂肪組織（WAT）已經被證實除了具有能量儲存功能外，還與內分泌和器官炎癥有關。從脂肪組織中提取和分析蛋白質對于了解許多生理/病理狀態越來越重要。但是由于白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中高脂肪和低蛋白含量，所以在技術上挑戰性。*目前生物樣品中水油乳化物zui難分離，具有*表面性質的帶孔徑的離心管柱和優化的無表面活性劑的緩沖液系統，可以快速有效的從脂肪組織勻漿中將水油乳化物分離。提取緩沖液比脂肪組織中的油冰點低，脂肪組織勻漿通過離心管柱能將水相和油相迅速分開，組織中
2018
05-04

丙烯酰胺凝膠電泳
丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的電泳方法。在這種支持介質上可根據被分離物質分子大小和分子電荷多少來分離。聚丙烯酰胺凝膠有以下優點：①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有格子是帶有酰胺側鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質，在聚合前可調節單體的濃度比，形成不同程度交鏈結構，其空隙度可在一個較廣的范圍內變化，可以根據要分離物質分子的大小，選擇
2018
05-04

感受態細胞制作
方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；C液稱取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混勻冰浴即可使用。劃線得到單菌落,37℃培養箱培養約17小時，挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種于裝有100mlS
2018
04-28

抗體和重組蛋白使用保存方法
無論是保存還是運輸，請避免反復凍融。反復凍融，冰晶會破壞抗體和重組蛋白的空間結構，導致蛋白變性形成多聚體和重組蛋白構象改變，從而降低抗體的結合能力，也加快了抗體球蛋白和重組蛋白的降解速度。抗體和重組蛋白保存得當與否，直接決定了抗體和重組蛋白的活性使用效果，如果保存得當，的抗體和重組蛋白活性大部分都可以維持數年。1.收到抗體和重組蛋白后的操作收到抗體和重組蛋白后（大部分抗體和重組蛋白是溶液態），請務必在4℃，12000rpm，離心3分鐘，再打開管蓋進行分裝、溶解和保存（如果抗體和重組蛋白體積小于5
2018
04-28

重組羧肽酶B 的性質與抗體堿性峰檢測
羧肽酶B(EC3.4.17.2)專一用于蛋白質C-末端堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸）的水解；又稱為肽酰-L-賴氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子量為35kD，等電點為6.0，zui適pH為7-9。羧肽酶B是抗體堿性峰檢測的特異酶，通過比較酶切前和酶切后的圖譜來計算抗體堿性變體的比例，對于抗體的發酵工藝和純化工藝穩定性的控制都具有重要的意義。而在抗體堿性峰的檢測中，沒有*統一的標準，如酶解緩沖液酶的用量，酶解時的溫度和時間等。而這些與酶的性質密切相關。可以選擇的羧肽酶B有兩種，一種是動
2018
04-27

逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR，rtpcr）
實驗方法原理逆轉錄-聚合酶鏈反應(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。實驗材料組織細胞試劑、試劑盒RNA提取試劑dNTP混合物TaqDNA聚合酶*鏈cDNA合成試劑盒儀器、耗材離心管離心機水浴鍋PCR管電泳儀凝膠圖像分析系統移液管移液槍離心管
2018
04-27

實驗室裝柱要點
空柱的準備準備步驟：空柱中篩網需要定期用0.5M的NaOH超聲清洗，并且用20%乙醇排除氣泡，內部接一定要確保擰緊，各個部件組裝完成后用水檢查氣密性。將空柱用柱夾固定，連接到層析儀中，保證水平和垂直，對于凝膠過濾填料的裝填，需要用水平儀檢查。填料勻漿的準備反復使用的填料：需要對填料進行再生，如果填料再生后仍然結塊明顯，攪拌后部分為絮狀或者有色素沉著，建議選用新填料。新填料：填料儲存液通常為20%乙醇，裝柱溶液根據填料的不同而不同，可能是水溶液，鹽溶液或者是有機溶液等。將上述已經交換到裝柱溶液中的
2018
04-26

病毒的細胞感染
慢病毒、腺病毒和AAV是常用的三種病毒載體，其各自的特點如下表。實際操作中，可根據不同的實驗需求選擇合適的病毒。慢病毒因其具有感染譜廣、表達時間長、安全性高等優勢而廣泛應用于細胞感染，是細胞實驗的首xuan工具。下面以不同癌種細胞模型的感染效果來展示慢病毒應用于細胞感染方面的表現。一、慢病毒感染不同癌種細胞模型效果圖1.膠質瘤細胞2.肺癌細胞

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