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2018
06-07

PI3K/Akt/mTOR信號通路
目的：通過特異性阻斷PI3K和mTOR，觀察HepG2和Hep3B細胞株PI3K/Akt/mTOR信號通路活性及生物學行為的改變，探討相關的分子機制。方法：在培養的HepG2、Hep3B人肝癌細胞株和人正常肝細胞株QSG-7701上，以免疫印跡方法（Westernblot）檢測各細胞株中PI3K（p110α亞單位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表達情況；分別用PI3K抑制劑LY294002（50μmol/ml）和mTOR抑制劑Rapamycin（RAPA
2018
06-05

過濾器的工作原理
過濾器待處理的水由入水口進入機體，水中的雜質沉積在不銹鋼濾網上，由此產生壓差。通過壓差開關監測進出水口壓差變化，當壓差達到設定值時，電控器給水力控制閥、驅動電機信號，引發下列動作：電動機帶動刷子旋轉，對濾芯進行清洗，同時控制閥打開進行排污，整個清洗過程只需持續數十秒鐘，當清洗結束時，關閉控制閥，電機停止轉動，系統恢復至其初始狀態，開始進入下一個過濾工序。設備安裝后，由技術人員進行調試，設定過濾時間和清洗轉換時間，待處理的水由入水口進入機體，過濾器開始正常工作，當達到預設清洗時間時，電控器給水力控
2018
06-04

如何維護原子吸收光譜儀
在分析實驗室中使儀器處于良好的狀態是很重要的。有規律的日常維護能夠確保儀器處于*的運行狀態。如何維護原子吸收光譜儀，維護應包括以下四個重要方面：1．普通的儀器維護2．使用的氣體的維護3．火焰組件的維護4．石墨平臺組件的維護日常維護的優點有以下幾點：l延長儀器壽命l減少停機時間l*儀器性能；增加分析人員對數據結果正確性的信心。如何維護原子吸收光譜儀普通的儀器維護灰塵和露水會在儀器表面積累，腐蝕性液體可能會濺到儀器上。為了降低危害，可以用蘸有水或中性洗滌劑的軟布擦拭儀器。嚴禁使用有機溶劑。樣品艙的光
2018
06-01

WB 或 IP 樣品制備的技術指導
在WB和IP實驗中，破碎細胞或組織與選擇和配制裂解液一樣重要。比起一些更軟的組織（如腦組織），在準備WB或IP的樣品時，緊密的纖維組織（如肌肉組織）需要更劇烈的方法；對于培養的原代細胞或細胞系，在準備WB和IP的樣品時需要一定的機械攪拌去提取蛋白。機械破碎樣品常規的方法和設備如下：組織高速勻漿儀通常破碎體積大的植物或者動物組織需要用可旋轉、帶有刀片的勻漿儀或者攪拌器.這些儀器通常通過一個電動的馬達帶動不銹鋼可旋轉切割刀片，可以從頂部或者底部啟動，這個過程中產生很少熱量，但是樣品需要置于冰上。勻漿
2018
06-01

多篇 SCI 發現用 RIPA 提蛋白存在問題，我們該如何應對？
這篇綜述重點說明使用RIPA裂解液提取總蛋白以及下游實驗中可能存在的問題。RIPA裂解液常用于從脊椎動物細胞和組織中提取總蛋白[1]。但是由于蛋白質間有較大的差異和非蛋白成份的干擾，所以從一個樣本中同時釋放和溶解所有蛋白質是非常困難的。特別是一些整合到膜上的蛋白質，或與其他蛋白質/核酸形成復合物時，就大大阻礙了提取效率。因此可以推斷，蛋白質在提取過程中或多或少的與在體內時情況不盡相同。經典RIPA裂解液中含有低濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS變性劑），脫氧膽酸（干擾蛋白質間相互作用）及其他成分。雖然
2018
05-31

RT-PCR的注意事項
一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用lv仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被lv仿腐蝕，故不能使用）。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然
2018
05-31

逆轉錄-聚合酶鏈反應實驗方法
逆轉錄-聚合酶鏈反應(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA轉錄系統。一、反轉
2018
05-30

流式細胞術常見問題集錦
1、流式細胞儀上的FL2-WFL2-AFL2-H分別是做什么的？FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度，FL2-H是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應用，用于去除粘連細胞。2、流式同型對照怎樣選擇？同型對照（IsotypeControl）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用annormalserum（與一抗相同的正常血清）（mustbethesamespeciesasprima
2018
05-30

流式細胞術的常用樣品制備方法
流式細胞術的實驗檢測對象是單細胞懸液，因此，在組織化學和免疫組織化學實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數，也需把樣品制備成細胞懸液，并要求被檢細胞大小為0.2～80pm，每個樣品中至少有20000個細胞，細胞濃度為105～107個／ml。制備成的單細胞懸液經熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。一．單層培養細胞單細胞懸液的制備1.棄去培養細胞(對數生長期)中的舊培養液，加入1～2ml0.25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養瓶，靜置消化2～3分鐘，待細胞逐漸
2018
05-30

恒溫金屬浴的操作方法
恒溫金屬浴采用微電腦控制和半導體制冷技術制造的一款恒濕儀產品，控濕精度高，制樣平行性好,儀器可配置多種模塊，可廣泛各種分析儀器樣品的保存、各種酶的保存和反應、核酸和蛋白質的變性處理、PCR反應、電泳的預變性和血清凝固，各種產品材料的老化等。行業行業遍及醫藥、化工、食品安全、質檢、環境等。恒溫金屬浴如何操作：1、熱塊預熱：給熱塊加熱20分鐘，使熱塊溫度均勻，紅燈亮為加溫，綠燈亮為恒溫，溫度表指示的是熱塊的測量溫度。2、設定溫度：用旋鈕調節到需要的溫度值，面板上的示值為設定溫度值。3、接通電源：檢查
2018
05-29

流式細胞術數據處理與分析
數據的顯示通?？煞譃橐痪S單參數直方圖（histogramplot）、二維點圖（dotplot）、二維等高圖（contour）和假三維圖（pseudo3D）等。下面簡述zui常用的單參數直方圖和二維點圖。1.單參數直方圖單參數直方圖是一維數據用得zui多的圖形，可用來進行定性分析和定量分析。橫坐標表示熒光信號或散射光信號強度的相對值，其單位用“道數”（channel）表示，橫坐標可以是線性的，也可以是對數的。縱坐標通常代表細胞出現的頻率或相對細胞數。下面以研究細胞周期為例說明如何分析單參數直方圖所
2018
05-29

流式細胞儀和流式細胞術指南篇
JayHaronPh.D.jaydotharonatgmaildotcomBDBiosciences,SanDiego,UnitedStates引用實驗材料和方法從1968年zui早的商品化流式細胞術(FC)和熒光激活細胞分類術(FACS)誕生以來,它們已得到大大改進。但要成為實驗室廣泛接受的技術，除成本因素外，還存在不少障礙。技術上的問題主要是細胞內低豐度分子的檢測，缺少“通用”細胞通透物質，細胞自發熒光的干擾效應，熒光分子間發射光譜的重疊，以及缺少可識別目標分子的試劑。特別是對于細胞分揀來說
2018
05-28

細胞培養過程中有哪些污染
細胞培養中的污染分為兩類，化學污染和生物污染?；瘜W污染化學污染是一些對細胞有毒性的或對細胞產生刺激的化學物質。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學試劑和質量較差的蒸餾水等。化學污染中比較引人注意的是細菌內毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質，對塑料等疏水性強的物質有很強的吸附能力。細菌內毒素可刺激部分細胞產生一些激素或細胞因子，對細胞生長和實驗結果產生影響。細菌內毒素是臨床上的zui主要的熱原（即注射到動物體內會導致動物發熱），所以通過細胞培養生產的疫苗、
2018
05-28

凝膠遷移實驗（EMSA）常見問答
1.什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗？凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA復合物或RNA復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢
2018
05-24

原代細胞培養中存在的六個錯誤做法
原代細胞培養與細胞株不同，兩者在培養過程中的操作方法也不一樣。下面是原代細胞操作過程中容易出現的6個錯誤及對應方法1.長時間水浴解凍因為原代細胞非常容易受到解凍過程的影響，所以在37℃水浴鍋中解凍時，要在水中擺動溶解。在細胞半溶后（不要等到全部溶解），迅速拿到生物安全柜或超凈臺中，用1ml的槍，抽出事先準備好的*培養基打入凍存管中，然后抽到培養瓶中，反復進行，直至*溶解2.把凍存管的細胞溶解后迅速離心如果原代細胞溶解后馬上離心，細胞所受的打擊可能比DMSO的毒性還要大，不建議采用這個方法。用帶有
2018
05-24

菌落 PCR 分析克隆的重組體實驗
菌落PCR分析克隆的重組體實驗試劑、試劑盒溴化乙錠Taq延伸PCR添加劑Tween2010%溶液dNTP溶液PCR緩沖液熱穩定DNA聚合酶引物儀器、耗材無菌槍頭瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑實驗步驟一、材料1.緩沖液、溶液和試劑溴化乙錠Taq延伸PCR添加劑（Stratagene)Tween20，10%溶液2.酶和酶緩沖液dNTP溶液（包含所有的4種dNTP，每種都是25mmol/L)PCR緩沖液，10X,用戶買熱穩定聚合酶時公司一并提供，或者PCR優化緩沖液，比如，Opti-PrimePCR優化試劑
2018
05-22

Strep-tag II磁珠技術問答
Strep-tagII磁珠海貍Strep-tagII磁珠可以在生理條件下純化得到使Strep-tag融合蛋白。與其他tag相比，這些溫和的純化參數能保存蛋白質的生物活性，并僅經一步層析后即可產出超過99%的純度。1.Strep-tagII磁珠純化的技術原理是什么呢？答：主要基于Strep–tagII多肽與Strep-Tactin（一種經過特殊工藝改造的鏈酶親和素）的相互作用，在生理緩沖液或是含有其他添加劑的環境下，帶有標簽的蛋白與固定化的StrepTactin親和純化，經過加有2.5mM脫硫生物
2018
05-22

GST融合蛋白純化磁珠技術問答
GST融合蛋白純化篇1.如何純化GST融合蛋白？2.可純化蛋白種類3.磁珠掛不上目的蛋白以下的處理方案的前提是樣本里面有目的蛋白，如果是包涵體需要變性?？赡芤唬航Y合條件不對理想的結合條件為pH6.5-8.0，純化之前確認磁珠是否采用緩沖液平衡以及蛋白樣本的pH值，低于pH6.5或高于pH8時，融合蛋白與磁珠結合不充分導致結合效率低?？赡芏簶颖局心康牡鞍椎臐舛绕湍康牡鞍椎臐舛冗^低，會嚴重影響磁珠與蛋白的結合。兩種方法可供選擇：a)濃縮蛋白樣本；b)增加磁珠的濃度可能三：檢查目的蛋白是否聚集沉淀
2018
05-22

His-tag蛋白純化磁珠技術說明
His-tag蛋白純化篇1.蛋白不吸附或親和力低首先確認純化前的樣品中是否有目標蛋白。（1）有目標蛋白，但大量穿透：a、蛋白不含有標簽或未能正確表達解決措施：WesternBlot鑒定目標蛋白是否有His-Tag。若沒有，需要重新構建載體，添加組氨酸標簽，并確認標簽正確表達。b、蛋白折疊導致組氨酸標簽未*暴露解決措施：在不變性條件下純化蛋白，在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素，這樣蛋白結構相對松散，而蛋白不會變性。在變性條件下純化蛋白，加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。如果蛋白有二
2018
05-22

如何選擇細胞培養板
細胞培養板的選擇：細胞培養板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U型和V型）；培養孔的孔數有6、12、24、48、96、384孔等；根據材質的不同有Terasaki板和普通細胞培養板。具體選擇時根據培養細胞的類型、所需培養體積及不同的實驗目的而定。平底和圓底（U型和V型）培養板的區別和選擇：貼壁細胞一般用平底培養板懸浮型細胞的培養一般用V型U型培養板亦多用于培養懸浮型細胞不同型狀的板子自然有不同用途。平底的什么類型的細胞都可用﹐但當細胞數目較少﹐如做克隆時﹐就用96孔平底板﹐另外﹐做MTT等實驗時

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