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培養干細胞的凍存2017/08/01

干細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。1．凍存細胞（1）選對數增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO1ml，5.6%NaHCO30.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養液中加入保護

細胞計數與存活的測試實驗方法2017/07/27

腫瘤細胞冷凍與復蘇是細胞培養的常規工作，可以解決細胞因為連續繼代造成的退變或轉化。細胞的原代培養和傳代培養以及細胞凍存和復蘇后都需要細胞計數。那么細胞計數與存活的測試實驗方法有哪些呢？1、原理：（1）計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。（2）血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm

轉化細胞培養技術中的準備工作2017/07/25

一、轉化細胞準備工作準備工作對開展細胞培養異常重要，推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試等。1、清潔、消毒、液體直接接觸細胞的用品要超凈處理——無非必須分子直接接觸細胞的用品要*消除微生物超凈和消毒過的樣品要密閉保存，標記消毒時間實驗室保持潔凈，隨時消毒盡量采用商品化一次性用品操作者也要清潔和消毒緩沖液要符合生理滲透壓（280～310mOsm）和pH

體外培養腫瘤細胞生物學檢測2017/07/20

一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學測定，主要的目的在于求得證明：所培養的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點?！拘螒B觀察】主要觀察細胞的一般形態，如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等?！炯毎L增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞

間質干細胞成脂和成骨誘導分化2017/07/18

成骨和成脂誘導是鑒定干細胞的一種重要的方法，也是zui常用、報道見得zui多的方法。成骨zui常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導zui常用是OilRedO（油紅O）染色法。下面介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。成骨誘導分化茜素紅染色方法和原理：茜素紅又名茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯。1%水溶液pH為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加鹽酸后變成黃色，加氫

轉化細胞大規模培養技術的操作方式2017/07/13

轉化細胞深層培養可分為：分批式、流加式、半連續式、連續式、連續式和灌注式五種。一、分批式培養（batchculture）是細胞規模培養發展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎。該方式采用機械攪拌式生物反應器，將細胞擴大培養后，一次性轉入生物反應器內進行培養，在培養過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增長和產物形成積累到適當的時間，一次性收獲細胞、產物、培養基的操作方式。該方式的特點:操作簡單。培養周期短，染菌和細胞突變的風險小。反應器系統屬于封閉式，培養過程中與外部環境沒有物料交換

腫瘤細胞培養方法2017/07/11

腫瘤細胞培養成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。1、取材：人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進行培養，如因故不能立即培養，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。2、培養基：腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴

ATCC細胞轉染技術介紹2017/07/06

ATCC細胞轉染方法不同，對轉染結果影響很大。常見的轉染方法有：1.磷酸鈣法：該方法利用磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞原理得到瞬時或穩定轉染結果，操作簡便但重復性差，不可用于原代細胞的轉染。2.DEAE-右旋糖苷法：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞，可用于瞬時轉染，方法相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用。3.電穿孔法：利用高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入。穩定轉染，瞬時轉染均適用。適用性廣但細胞致死率高，DNA

細胞死亡的檢驗方式2017/07/04

ATCC細胞發生凋亡時具有固有的形態特征,如細胞核表現縮小、染色質邊緣化、凝集,凋亡晚期還會出現由核碎片與胞質內的部分細胞器混合在一起,且被細胞膜包裹形成的凋亡小體。DNA特異性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區進行非嵌入式結合,從而使細胞核著色,在紫外光激發時會出現明顯的熒光。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細胞染色質的形態學變化、膜結構及通透性的改變,從而鑒別凋亡細胞、正常細胞及壞死細胞。細胞凋亡的形態學檢測結果直觀,至

細胞分裂指數操作說明書2017/06/29

【實驗用品】材料：貼壁培養的ATCC細胞器材：離心機、顯微鏡、血細胞計數板試劑：Hanks液、0．25％胰蛋白酶、含10％小牛血清／胎牛血清的DMEM培養基(根據實驗需要也可以是其他種類的培養基)【實驗步驟】(1)用胰蛋白酶消化處于對數生長期的單層培養細胞，細胞置于10ml離心管中，1000r／min離心5min，棄上清。(2)加入含血清的DMEM培養基，制備單細胞懸液。(3)吹打均勻后，對ATCC細胞進行計數。(4)按2x104～5x104／ml的密度將細胞接種到24孔細胞培養板中。(5)每天

細胞生長曲線的繪制操作步驟2017/06/27

ATCC細胞實驗用品材料：貼壁培養的細胞器材：24孔培養孔板、吸管、膠帽、離心管、培養皿、半對數坐標紙、蓋玻片、細胞計數板、酒精棉球、酒精燈、離心機、倒置顯微鏡、普通光學顯微鏡、超凈工作臺、CO2培養箱試劑：Hanks液、DMEM培養基(含10％小牛血清)、0.25％胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液實驗步驟(1)消化：用0．25％胰蛋白酶溶液消化處于對數生長期的單層培養細胞，收集消化的細胞于10ml離心管中。(2)離心：500～1000r／min離心5min，棄上清。(3)加入DMEM培養基(含10％

分析培養腫瘤細胞狀態欠佳的原因2017/06/22

1、腫瘤細胞培養基的新鮮程度：一般加入血清后的*培養基，2周內用完。否則血清有效成分失活，影響細胞培養。建議：*培養基一次不要配太多，200ml以下。或根據用量決定。2、細胞外源微生物的污染：細胞不宜長期體外培養，因為外源微生物污染的幾率大大提高。易發現和難發現的。影響細胞狀態。建議：實驗前凍存一批細胞，隔幾個月重新復蘇。即保證實驗所用細胞代數一致，又將外源污染的后果降到zui低。3、排除其他原因：如更換培養條件（血清、培養基等）；腫瘤細胞使用器皿的潔凈程度；人表皮黑色素細胞-深色素微小RNA英

血管內皮細胞特性2017/06/20

1．血管內皮細胞重要標志（1）轉化細胞第Ⅷ因子關連抗原，可以由全身所有血管內皮細胞產生，檢測這一因子主要用相應抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對牛的內皮細胞沒有交叉反應。兔疫熒光間接法測定該因子，陽性細胞出現細長的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細胞邊緣顆粒較少。（2）Weibel-Palade小體，該小體是血管內皮細胞又一特異性的標志。電子顯微鏡下，呈現0.1～0.3μm,長0.5～5μm的橢圓形棒狀結構。上述的VWF就是該小體產生的。2．培養的大動脈內皮細胞形態培養的內皮細胞從形態學上可

ATCC細胞肉眼觀察檢測方法2017/06/15

ATCC細胞一般常規檢查用肉眼即可觀察，主要看培養液的顏色和透明度的變化。培養細胞的觀察檢測方法大多數細胞適于在pH7.2～7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6對細胞有害，甚至造成細胞退化或死亡。細胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環境對細胞生長有利。隨細胞數量的增多、代謝加強，釋放CO2增多，使pH降低。為了維持培養基恒定的pH，多在培養基中加入磷酸鹽等緩沖劑。對細胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養或活細胞觀察時能維持較恒定的pH值。

細胞常見的轉染方法分析2017/06/13

ATCC細胞常見的轉染方法有：1.磷酸鈣法：該方法利用磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞原理得到瞬時或穩定轉染結果，操作簡便但重復性差，不可用于原代細胞的轉染。2.DEAE-右旋糖苷法：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞，可用于瞬時轉染，方法相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用。3.電穿孔法：利用高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入。穩定轉染，瞬時轉染均適用。適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大，需根據不同細胞類型優

腫瘤細胞培養技術操作注意事項2017/06/08

1.腫瘤細胞實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。2.無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等

轉化細胞實驗室*儀器簡單介紹2017/06/06

一、CO2培養箱CO2培養箱是轉化細胞培養的*儀器，它為細胞提供了一個體外培養的舒適環境，如適宜的溫度、濕度、酸堿度、O2濃度等。細胞在體外培養時很容易受到各種細菌、微生物的感染，因此，CO2培養箱的滅菌和抑菌能力就顯得尤為重要。二、純水系統細胞培養用水一般要求雙蒸水(0.8MΩ以上)，實際上普通蒸餾水經玻璃器皿中按標準方法蒸餾二次得到的雙蒸水是不能滿足要求的，而且水中的內毒素直接參與細胞凋亡，血清中內毒素含量越低，對細胞毒性越小，越利于細胞的生長和傳代;內毒素含量過高，會直接導致細胞提前老化。

腫瘤細胞培養時注意事項2017/06/01

腫瘤細胞培養時注意事項1.玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上;2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時以上;3.培養基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養基內，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;4.消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-2

ATCC細胞培養過程中出現的問題和解決方法2017/05/25

一、培養ATCC細胞不貼壁可能原因：胰蛋白酶消化過度支原體污染培養基pH值過堿（NaHCO3分解）細胞老化接種細胞起始濃度太低或太高解決方法：縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度分離培養物，檢測支原體。清潔支架或培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。使用無菌醋酸溶液調整pH值或充入無菌CO2啟用新的保種細胞調節*接種細胞濃度二、懸浮細胞成簇可能原因：培養液中含鈣、鎂離子；支原體污染；蛋白酶過度消化使得細胞裂解；DNA污染解決方法：用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕巧吹吸細胞獲得單細胞懸液；分離培養

介紹在細胞培養過程中經常用到的培養用液有哪些2017/05/23

一、干細胞平衡鹽溶液(balancedsaltsolution,BSS):主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡單的BSS是Ringer。D-Hank"s與Hank"s的一個主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank"s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養條件，Hank"s平衡液僅含有0.35g/LNaHCO